本文選題：DNMT1　切入點：miRNA-20a　出處：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤,具有侵襲性強、惡性進展快、極易復發(fā)、預后差等特點。雖然以手術為主、結合放療和化療為輔的綜合治療方法使膠質(zhì)瘤患者的生存期有所延長,但其總體的治療效果仍然欠佳�；熢趷盒阅z質(zhì)瘤臨床治療中的作用越來越被重視,而替莫唑胺是目前我們臨床治療神經(jīng)肢質(zhì)瘤的一線化療藥物,但替莫唑胺耐藥成為膠質(zhì)瘤化療失敗的主要原因。肢質(zhì)瘤對替莫唑胺耐藥的機制尚不完全清楚,尋找預防和治療膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥的新型靶標,對進一步提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療水平具有重大意義。近年來隨著微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)研究的持續(xù)深入進行,發(fā)現(xiàn)miRNAs在各類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中經(jīng)常扮演著非常重要的角色,根據(jù)不同的靶向基因可能擁有與類似癌基因或抑癌基因的作用,且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞化療耐藥中也發(fā)揮著重要作用。miRNAs是一類大小約19-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,普遍存在于真核生物細胞中。大部分miRNA主要通過與靶基因mRNA3'末端非翻譯區(qū)(3' UTR)完全或不完全互補的特異性結合使其降解,偶爾也與靶基因mRNA 5'末端非翻譯區(qū)(5' UTR)結合,在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因翻譯,從而實現(xiàn)基因表達的負性調(diào)控。miR-20a是miR-17-92基因簇的一員,該基因簇共包含7個miRNAs:miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和 miR-92a-16。目前的研究顯示miR-20能促進腫瘤細胞生長增殖、侵襲遷移,抑制細胞凋亡,在肢質(zhì)瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。本課題前期實驗研究證明miR-20a在肢質(zhì)瘤細胞內(nèi)高表達且負向調(diào)控靶基因LRIG1,與促進膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥相關;LRIG1可負性調(diào)節(jié)EGFR信號通路而發(fā)揮抑癌基因作用,增加膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠調(diào)控約50%miRNAs的表達,而這其中又有約近半數(shù)的miRNAs在大量人類惡性腫瘤中存在異常的甲基化修飾。miRNAs啟動子區(qū)域CpG島甲基化程度的改變可以影響miRNA表達和下游目標mRNAs的調(diào)節(jié)。甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)介導的DNA甲基化是表觀遺傳學基因調(diào)控的一個主要手段。DNA甲基化是在DNMTs(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b等)催化下以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體,將甲基基團轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上,使得5C位點上的氫被活性甲基基團取代而轉(zhuǎn)變成5-mC(5-甲基胞嘧啶)的化學修飾過程。目前研究發(fā)現(xiàn)DNMTs與多種癌癥化療耐藥相關,但DNMTs參與膠質(zhì)瘤耐藥的機制尚未清楚且研究較少。綜上所述,本課題旨在通過對DNMT1表達與miR-20a啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的研究,從而發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常與miR-20a表達之間的關系,研究DNMT1調(diào)節(jié)miR-20a表達及對其靶基因LRIG1和其下游信號通路的影響,進而明確DNMT1和miR-20a參與膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的潛在機制。本課題研究結果有望為克服神經(jīng)肢質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥提供新的有效方法。目的研究DNMT1通過miR-20a調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥性的分子機制。方法采用替莫唑胺長期濃度梯度遞增法建立人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥模型細胞株(U251/TMZ),并檢測耐藥細胞株的相關耐藥基因表達水平確定耐藥性。在體外實驗膠質(zhì)瘤細胞(U251)水平和在體內(nèi)實驗模式動物(裸鼠)水平分別研究驗證DNMT1通過調(diào)節(jié)miR-20a表達對其靶基因LRIG1和其下游信號通路的影響而參與肢質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的機制。結果(1)人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥細胞株(U251/TMZ)成功建立,具有穩(wěn)定的耐藥性。(2)U251/TMZ細胞株中DNMT1的表達水平明顯低于正常U251細胞株,而miR-20a表達水平明顯高于正常U251細胞株。(3)DNMT1通過調(diào)節(jié)miRNA-20a基因啟動子甲基化水平來調(diào)節(jié)miR-20a和LRIG1的表達。(4)miR-20a-LRIG1軸是DNMT1參與肢質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥的下游信號靶點。(5)DNMT1-miR-20a-LRIG1 軸調(diào)控 EGFR/AKT/mTOR信號通路活性。結論:在體外和體內(nèi)實驗均證明DNMT1通過調(diào)節(jié)miRNA-20a基因啟動子甲基化水平來調(diào)節(jié)miR-20a表達,繼而調(diào)控LRIG1的表達,并且通過miR-20a/LRIG1調(diào)控下游EGFR/AKT/mTOR信號通路參與肢質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥的調(diào)節(jié)機制。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：1658676