本文選題：USP22　切入點：膠質(zhì)瘤　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：以成人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為主要代表的惡性膠質(zhì)瘤被認(rèn)為是顱腦腫瘤中最常見的一種腫瘤類型。盡管近些年來對惡性膠質(zhì)瘤采取了以手術(shù)為主,輔以放化療的綜合治療策略,但是對患者的中位生存期并沒有多大的延長,僅為14個月左右。惡性膠質(zhì)瘤通常具有快速增殖、遷移、侵襲、易復(fù)發(fā)以及對放療抵抗和化療耐藥等特點。針對惡性膠質(zhì)瘤難治易復(fù)發(fā)的主要原因,目前腫瘤干細(xì)胞學(xué)說被大部分人所接受。即人們發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)瘤實體內(nèi)部,存在著一小部分側(cè)群細(xì)胞,被稱為是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC),它們具有和神經(jīng)干細(xì)胞相似的特點,比如能形成神經(jīng)球,能進(jìn)行自我更新以及能被誘導(dǎo)分化。常規(guī)的手術(shù)切除以及放化療只能做到“治標(biāo)”,即去除和消滅已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而對于具有放化療抗性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞側(cè)群則缺乏明顯的殺傷效果,因此這些干細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行不對稱自我復(fù)制,引起腫瘤的復(fù)發(fā)。因此針對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究對改善惡性膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀具有重大的意義。近些年來,對膠質(zhì)瘤干性的相關(guān)分子研究當(dāng)中,多梳基因(polycomb genes)一直是熱點所在。這些基因又能形成兩個復(fù)合物,即以Bmi1為代表的多梳抑制復(fù)合物1(PRC1)和以Ezh2為主的多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)。這些基因平時通過表觀遺傳修飾作用調(diào)控著眾多下游基因的轉(zhuǎn)錄。正常情況下,干細(xì)胞的自我更新復(fù)制和分化過程是受到體內(nèi)嚴(yán)格的控制的。多梳基因的的異常表達(dá)往往會引起抑癌基因的轉(zhuǎn)錄失常并引起某些干性相關(guān)信號通路的異常激活,促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的形成和腫瘤的發(fā)展。值得注意的是,2005年由Glinsky帶領(lǐng)的實驗團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了一個由11個基因所組成的“death-from-cancer”的基因譜,這些基因被認(rèn)為腫瘤的干性密切相關(guān),對人類常見的絕大多數(shù)惡性腫瘤的侵襲,轉(zhuǎn)移以及預(yù)后都具有重要的預(yù)測價值。而這其中就有多梳基因Bmi1和最近才被定義為腫瘤干性相關(guān)分子的去泛素化酶USP22。作為去泛素化酶(Dub)家族中最大的去泛素化特異蛋白水解酶(USP)亞族的成員之一,USP22對細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及免疫環(huán)境都起著重要的調(diào)節(jié)作用。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制上,USP22能參與基因的表觀遺傳修飾。一方面USP22屬于SAGA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的成員,能參與靶基因的去乙�；D(zhuǎn)錄調(diào)控。另一方面,USP22可以直接使組蛋白ub H2A和ub H2B去泛素化,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在翻譯后修飾的調(diào)控上,USP22可以水解目標(biāo)蛋白的泛素化標(biāo)簽,避免其蛋白水解,提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的底物蛋白有SIRT1、TBP1,FUBP1和RCAN1等。研究發(fā)現(xiàn),USP22在許多惡性腫瘤中都處于高表達(dá),如胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等,并能促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),USP22在不同的腫瘤中能參與多個促癌信號通路的調(diào)控,如JAK-STAT信號通路,雄激素受體(AR)信號通路,局部黏附激酶(FAK)信號通路以及由Bmi1介導(dǎo)的INK4a/ARF和AKT信號通路。目前已有個別報道表明相比于正常腦組織,USP22在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)更高,且蛋白表達(dá)水平與腫瘤的級別呈正相關(guān)以及和患者的存活時間呈負(fù)相關(guān)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,敲減USP22能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂G1/S期的阻滯以及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,但是除了影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡外,USP22能否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的其他惡性生物學(xué)行為,如增殖、遷移和侵襲目前尚不清楚。尤其是作為腫瘤干性相關(guān)標(biāo)記物,USP22能否影響膠質(zhì)瘤的干性更值得去研究。而作為去泛素化酶,USP22的促癌作用無疑與其對下游一系列底物癌蛋白的穩(wěn)定密切相關(guān)。因此,USP22對于腫瘤干性的維持很大程度上也與其對干性基因相關(guān)蛋白的穩(wěn)定有關(guān)。而作為“death-from-cancer”的基因譜的主導(dǎo)成員,Bmi1對許多基因都能起到表觀遺傳修飾的作用,從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤中,已經(jīng)有研究證明Bmi1處于高表達(dá)水平,它不僅能促進(jìn)已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,降低放化療敏感性,而且更重要的是它還能維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活和自我更新復(fù)制,抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡和避免免疫系統(tǒng)的攻擊。而敲除Bmi1能顯著降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成以及致瘤能力。因此降低惡性膠質(zhì)瘤中Bmi1的水平,對消滅膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有重大的意義。而已有相關(guān)研究表明,Bmi1在體內(nèi)是一種半衰期較短的小分子蛋白,其翻譯后水平受到由E3泛素連接酶介導(dǎo)的蛋白降解途徑的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶β-Trcp以及Spop均能使Bmi1泛素化從而影響其表達(dá)水平。鑒于在體內(nèi),泛素化和去泛素化是兩個相互拮抗的過程,因此Bmi1在腫瘤中蛋白水平的高表達(dá)很大程度上依賴于去泛素化酶的穩(wěn)定作用,因此探尋在惡性膠質(zhì)瘤中穩(wěn)定Bmi1的去泛素化酶就至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)在不少惡性腫瘤中去泛素化酶USP22與Bmi1經(jīng)常共同處于高表達(dá)狀態(tài),尤其在胃癌中還發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān),在結(jié)腸癌以及非小細(xì)胞肺癌中也有USP22調(diào)控Bmi1表達(dá)的報道,進(jìn)一步提示兩者之間的緊密關(guān)系。通過查閱Human protein atlas數(shù)據(jù)庫,我們同樣發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在惡性膠質(zhì)瘤中也處于共同高表達(dá)。鑒于目前在膠質(zhì)瘤中,Bmi1高表達(dá)水平機制并不明確。我們基于上述種種事實,提出了我們的假設(shè),即在膠質(zhì)瘤中Bmi1的高表達(dá)可能是由USP22的去泛素化穩(wěn)定機制介導(dǎo)的,而USP22對于膠質(zhì)瘤干性的影響也與其對Bmi1的穩(wěn)定密切相關(guān)。本文章中可分為五個部分。第一部分我們通過30例來自我院的不同級別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(WHO II級和WHO IV級各15例)中對USP22的免疫組化以及結(jié)合Human protein atlas數(shù)據(jù)庫分析,再次驗證了在USP22的蛋白表達(dá)在正常腦組織中、低級別膠質(zhì)瘤以及高級別膠質(zhì)瘤中逐漸升高,生存分析發(fā)現(xiàn)USP22高表達(dá)提示膠質(zhì)瘤預(yù)后不良。第二部分我們以U251惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對象,對USP22的生物學(xué)功能進(jìn)行了相關(guān)的研究,在體外實驗中發(fā)現(xiàn)敲減USP22能減慢U251細(xì)胞的增殖,遷移以及侵襲能力。鑒于USP22被認(rèn)為與腫瘤干性相關(guān),因此第三部分我們以在干細(xì)胞培養(yǎng)液中對U251、U87以及GBM-HSF三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)干培養(yǎng),以成球能力作為判斷腫瘤干性的指標(biāo),著重對USP22是否能影響膠質(zhì)瘤腫瘤干性進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)敲除USP22以后,上述三種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的成球能力均有減弱。利用熒光定量PCR來檢測在貼壁和成球兩種條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干性基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)USP22的敲除會引起多個干性基因的轉(zhuǎn)錄水平降低。利用western blot蛋白印跡法檢測在貼壁和成球兩種培養(yǎng)條件下USP22的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,成球狀態(tài)下USP22的表達(dá)量明顯高于貼壁狀態(tài)下的表達(dá)。第四部分我們對USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為尤其是腫瘤干性的機制進(jìn)行了研究。為了驗證我們前面的推斷,我們著重針對USP22與Bmi1之間的表達(dá)以及調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了探索。首先通過對30例不同級別的膠質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行免疫組化,我們發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1共定位在細(xì)胞核,與低級別膠質(zhì)瘤中相比兩者的表達(dá)在高級別膠質(zhì)瘤中更高,且在同一個腫瘤組織中兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)出較強的正相關(guān)性。在HEK293FT和U251細(xì)胞中進(jìn)行免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在細(xì)胞核中分布具有很強的重疊性,且通過免疫熒光強度也可以看出兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。接著我們再次驗證了Bmi1的蛋白水平受泛素化途徑調(diào)控。通過免疫共沉淀和免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)在HEK293FT細(xì)胞中外源性過表達(dá)的USP22能與Bmi1直接結(jié)合相互作用,從而穩(wěn)定Bmi1的蛋白水平,并且這是以來USP22的去泛素化酶活性的。而在內(nèi)源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,敲除USP22后,Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平有所升高,而蛋白水平卻呈現(xiàn)下降趨勢,也間接說明了USP22在蛋白水平上對Bmi1起到了穩(wěn)定的作用。而敲減Bmi1的表達(dá)后,USP22的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,說明Bmi1可能參與USP22的轉(zhuǎn)錄抑制。最后鑒于PRC復(fù)合物對腫瘤干性影響的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1復(fù)合物的成員分子,我們同時對PRC2復(fù)合物的一些成員進(jìn)行了免疫印跡蛋白水平的檢測,發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性USP22敲減后PRC2復(fù)合物相關(guān)成員Ezh2,Suz12與H3K27me3的表達(dá)均無明顯變化。第五部分對USP22和Bmi1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的具體下游分子機制進(jìn)行了初步探究,通過相關(guān)基因芯片分析并挑選基因進(jìn)行驗證后發(fā)現(xiàn),USP22和Bmi1能共同調(diào)控許多下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,這些靶基因很多都與細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌以及細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。第一部分USP22在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和預(yù)后研究目的:再次通過我院的臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本結(jié)合權(quán)威腫瘤分子生物學(xué)信息庫數(shù)據(jù)驗證USP22在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)水平,并研究USP22水平對患者生存期的影響,突出USP22在膠質(zhì)瘤中的致癌性。方法:通過在長征醫(yī)院神經(jīng)外科收集的30例不同級別的膠質(zhì)瘤組織石蠟切片(WHO II級和WHO IV級各15例)以及5例正常腦組織中對USP22進(jìn)行免疫組化染色,比較高級別膠質(zhì)瘤、低級別膠質(zhì)瘤以及正常腦組織中USP22的表達(dá)水平差異。通過在Human protein atlas權(quán)威腫瘤數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org/)中查詢USP22的相關(guān)蛋白表達(dá)信息來進(jìn)一步驗證實驗結(jié)的可靠性。結(jié)合隨訪資料對患者總生存期進(jìn)行生存分析,明確USP22與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:通過30例不同級別的膠質(zhì)瘤以及5例正常腦組織中對USP22的免疫組化的結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)USP22的蛋白表達(dá)在正常腦組織中、低級別膠質(zhì)瘤以及高級別膠質(zhì)瘤中逐漸升高,這與Human protein atlas上的結(jié)果一致。USP22高表達(dá)提示患者的預(yù)后不良。結(jié)論:USP22在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),且隨著腫瘤惡性程度增高而表達(dá)增高,其高表達(dá)提示患者的預(yù)后不良,提示USP22與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。第二部分USP22對惡性膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響目的:研究USP22對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。方法:我們分別構(gòu)建了兩條USP22sh RNA慢病毒感染U251細(xì)胞株。并利用western blot蛋白印跡法驗證了這兩條sh RNA的有效性。隨后我們利用WST-1法檢測U251細(xì)胞的增殖能力并繪制了增殖曲線,分別在24h、48h以及72h三個時間點和陰性對照組做了增殖能力的比較。利用Wound healing劃痕實驗檢測了U251細(xì)胞的遷移能力,并分別在18h和36h和陰性對照組做了遷移能力的比較。利用Transwell實驗檢測了U251的侵襲能力,并在72h和陰性對照組做了侵襲能力的比較。結(jié)果:在U251細(xì)胞中當(dāng)USP22表達(dá)被抑制后,在第一個24h內(nèi)三組細(xì)胞的增殖速度無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,但是隨著時間的推移,在48h和72h兩個時間點USP22sh RNA慢病毒感染組U251的細(xì)胞增殖速度明顯減慢,和陰性對照組之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.001)。當(dāng)USP22被敲除后,我們在劃線后18h和36h分別對兩組細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行了測量,發(fā)現(xiàn)USP22sh RNA慢病毒感染的U251細(xì)胞的遷移速度在這兩個時間點上與陰性對照細(xì)胞相比均有明顯的減慢,且差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)。利用Transwell實驗檢測了U251的侵襲能力,并在72h和陰性對照組做了侵襲能力的比較,發(fā)現(xiàn)USP22sh RNA慢病毒感染的U251細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱,且差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)。結(jié)論:USP22對維持U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為有重要的作用。第三部分USP22對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的影響目的:以成球能力作為腫瘤干性能力的指標(biāo),探究USP22在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中對腫瘤干性的影響。方法:我們在U251和U87細(xì)胞中,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)慢病毒USP22sh RNA的細(xì)胞系,在GBM-HSF細(xì)胞中構(gòu)建了可調(diào)控的USP22sh RNA表達(dá)系統(tǒng),并利用熒光定量PCR和western blot蛋白印跡技術(shù)對sh RNA的干擾效率以及可誘導(dǎo)USP22sh RNA表達(dá)系統(tǒng)的有效性進(jìn)行了驗證。在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液中,對U251、U87和GBM-HSF細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞成球培養(yǎng),通過統(tǒng)計分析研究USP22對三種細(xì)胞系干細(xì)胞成球的影響。利用熒光定量PCR來檢測在貼壁和成球兩種條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干性基因的表達(dá)變化。利用western blot蛋白印跡法檢測在貼壁和成球兩種培養(yǎng)條件下USP22的表達(dá)差異。結(jié)果:在U251和U87細(xì)胞中USP22sh RNA的效率理想,在GBM-HSF細(xì)胞中,經(jīng)過強力霉素Dox處理后,USP22的m RNA水平下降了約75%,蛋白表達(dá)水品也明顯減少。在無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液中將貼壁的U251、U87和GBM-HSF轉(zhuǎn)干培養(yǎng)后,三種細(xì)胞均具有成球的能力。在這三種細(xì)胞系中,USP22的表達(dá)抑制均導(dǎo)致了細(xì)胞成球直徑的減小,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.001)。我們在貼壁的U251細(xì)胞以及成球的GBM-HSF細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)干性基因的檢測,均發(fā)現(xiàn)USP22的內(nèi)源性表達(dá)抑制會引起部分干性基因的轉(zhuǎn)錄水平的下降。通過western blot免疫印跡法在轉(zhuǎn)干前后兩種狀態(tài)下的U251中進(jìn)行了USP22蛋白水平的檢測,發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下,USP22的蛋白水平較在分化培養(yǎng)條件下要明顯增高。結(jié)論:1.USP22是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物之一,在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中有更高的表達(dá)。2.USP22對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性起著重要的維持作用,具體機制和影響干性基因的轉(zhuǎn)錄水平有一定的關(guān)系。第四部分USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的機制研究目的:研究USP22影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的機制并重點探索USP22與Bmi1之間的表達(dá)以及調(diào)控關(guān)系。方法:通過在長征醫(yī)院神經(jīng)外科收集的30例不同級別的膠質(zhì)瘤組織石蠟切片(WHO II級和WHO IV級各15例)中分別對USP22和Bmi1進(jìn)行免疫組化染色,并根據(jù)染色深度以及染色面積等指標(biāo)計算出總的表達(dá)強度。通過Graphpad Prism軟件來分析計算在同一個腫瘤組織中兩者之間在表達(dá)上的相關(guān)性。在HEK293FT細(xì)胞中同時過表達(dá)外源性USP22與Bmi1,并利用免疫熒光染色來觀察USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位分布以及表達(dá)上的關(guān)系;在U251細(xì)胞中,利用免疫熒光染色來觀察內(nèi)源性USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位以及表達(dá)水平上的關(guān)系。在HEK293FT細(xì)胞中過表達(dá)了外源性GFP-Bmi1質(zhì)粒,用western蛋白印跡法檢測經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理后,外源性Bmi1的蛋白水平變化。在HEK293FT細(xì)胞中分別同時外源性共轉(zhuǎn)染Bmi1和USP22野生型/酶活性突變型,用western蛋白印跡法檢測外源性USP22對Bmi1的蛋白水平的影響。在敲減USP22的U251細(xì)胞中,運用熒光定量PCR和免疫印跡的方法分別檢測Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。運用免疫共沉淀的方法在HEK293FT細(xì)胞中檢測USP22與Bmi1的直接相互作用。在U251細(xì)胞中,運用實時熒光定量PCR法檢測Bmi1對USP22的轉(zhuǎn)錄水平的影響。最后鑒于PRC復(fù)合物對腫瘤干性影響的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1復(fù)合物的成員分子,我們同時對PRC2復(fù)合物的一些成員進(jìn)行了免疫印跡蛋白水平的檢測。結(jié)果:通過30例子不同級別的膠質(zhì)瘤中對USP22與Bmi1的免疫組化的結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)相較于低級別膠質(zhì)瘤,在高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)更高,且在同一個腫瘤組織中兩者的表達(dá)水平具有較強的正相關(guān)性。我們通過在HEK293FT細(xì)胞中同時過表達(dá)外源性USP22與Bmi1以及在U251細(xì)胞中,利用免疫熒光染色來分別觀察外源性和內(nèi)源性USP22與Bmi1在亞細(xì)胞定位分布以及表達(dá)水平上的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)USP22與Bmi1在細(xì)胞核中分布具有很強的重疊性,且通過免疫熒光強度也可以看出兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。在HEK293FT細(xì)胞中驗證了Bmi1的蛋白水平受泛素化水平的影響。并發(fā)現(xiàn)外源性過表達(dá)野生型的Flag-USP22能增加GFP-Bmi1的表達(dá),而過表達(dá)Flag-USP22C185S酶活性突變體不影響B(tài)mi1的蛋白水平。在U251細(xì)胞中,USP22的內(nèi)源性表達(dá)抑制會引起內(nèi)源性Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平的明顯上升,而Bmi1的蛋白水平卻有不同程度的下降趨勢,尤以慢病毒干擾效率較強的USP22sh RNA1組明顯。在HEK293FT細(xì)胞中通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)外源性過表達(dá)野生型的Flag-USP22可以與外源性GFP-Bmi1直接相互作用,而過表達(dá)Flag-USP22C185S酶活性突變體不能直接結(jié)合GFP-Bmi1。在U251細(xì)胞中利用慢病毒干擾抑制Bmi1的內(nèi)源性表達(dá)受后,發(fā)現(xiàn)USP22的轉(zhuǎn)錄水平有明顯的上升。最后免疫印跡法發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性USP22敲減后PRC2復(fù)合物相關(guān)成員Ezh2,Suz2與H3K27me3的表達(dá)均無明顯變化。結(jié)論:1.USP22與Bmi1共同定位于細(xì)胞核,且在亞細(xì)胞定位層面的分布擬合度高。2.與低級別膠質(zhì)瘤相比較,USP22與Bmi1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平明顯升高。不僅在膠質(zhì)瘤臨床組織中,而且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,USP22與Bmi1的表達(dá)水平存在一定的正相關(guān)性。3.Bmi1的蛋白穩(wěn)定性確實受到泛素化水平的調(diào)控。4.在無轉(zhuǎn)錄影響的干擾下,USP22能穩(wěn)定Bmi1的蛋白水平,且這種穩(wěn)定作用是通過兩者的直接作用而實現(xiàn)的,與USP22的去泛素化酶活性位點緊密相關(guān)。5.在U251細(xì)胞中,內(nèi)源性的USP22一方面能抑制Bmi1的轉(zhuǎn)錄水平,另一方面又能維持Bmi1蛋白穩(wěn)定性。6.在U251細(xì)胞中USP22與Bmi1表達(dá)的正相關(guān)性無法用Bmi1對USP22的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來解釋。7.在U251細(xì)胞中,PRC2復(fù)合物不參與USP22對膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。第五部分USP22和Bmi1共同影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的分子機制的初步探討目的:研究受USP22與Bmi1共同影響的基因譜與膠質(zhì)瘤干性的關(guān)系。方法:在感染USP22sh RNA1、Bmi1sh RNA以及陰性對照的U251細(xì)胞中用Agilent表達(dá)譜基因芯片來分析并找出共同受USP22和Bmi1影響的基因,分析這些基因所富集的相關(guān)信號通路。在以上這些基因中,通過查找Pubmed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫并用Excel軟件進(jìn)一步篩選出在膠質(zhì)瘤中有較明確的生物學(xué)功能的基因,并隨機挑選了8個基因用實時熒光定量RCR法驗證芯片結(jié)果。結(jié)果:與陰性對照組相比,USP22與Bmi1的內(nèi)源性表達(dá)抑制后,各自有2151和1488個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了2倍以上的改變,且其中有413個基因是受兩者共同影響的。通過相關(guān)富集和信號通路分析發(fā)現(xiàn)這413個基因主要與細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞分化等信號通路有關(guān)。我們對膠質(zhì)瘤中有較明確的生物學(xué)功能的基因進(jìn)行了遴選,發(fā)現(xiàn)這些基因參與的生物學(xué)功能基本與上述的幾個通路是相符合的。在這些基因中,我們隨機選擇了8個基因,發(fā)現(xiàn)這些基因中大部分都與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性維持有關(guān)。芯片分析結(jié)果顯示這8個基因在USP22和Bmi1表達(dá)水平受到干擾后,轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下降,并用熒光定量PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行了驗證,發(fā)現(xiàn)與芯片結(jié)果是一致的。結(jié)論:1.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,USP22與Bmi1各自都直接或間接地影響著許多基因的表達(dá),而其中有不少比例的基因受到兩者的共同影響,也從一個側(cè)面驗證了USP22與Bmi1在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上的高相關(guān)性。2.受USP22與Bmi1共同影響的基因中,大部分與細(xì)胞外基質(zhì),神經(jīng)內(nèi)分泌,免疫以及細(xì)胞分化等相關(guān)通路有關(guān)。3.通過對芯片結(jié)果驗證,USP22與Bmi1對許多干性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有維持作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1656526