本文選題：原發(fā)性難治性癲癇　切入點(diǎn)：負(fù)性協(xié)調(diào)刺激分子PD-1　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分負(fù)性協(xié)調(diào)刺激分子PD-1在原發(fā)性難治性癲癇患者周圍性免疫調(diào)控中的研究目的原發(fā)性難治性癲癇病因不明,危害大,隨著發(fā)病機(jī)理地不斷探索,大量證據(jù)表明癲癇的發(fā)生可能與非神經(jīng)性改變有關(guān),免疫因素對(duì)癲癇的反復(fù)發(fā)作發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,調(diào)節(jié)性CD4+CD25high T細(xì)胞(T regulatory cells,Treg)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)目前已成為免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵參與者。因此我們著手于PD-1通路與CD4+CD25low和CD4+CD25high Treg細(xì)胞的作用研究難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制,力求在該通路中尋找到難治性癲癇的病因和治療價(jià)值。本研究首先通過體外實(shí)驗(yàn)探討PD-1在原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作患者、原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者和健康志愿者外周血中CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴細(xì)胞的表達(dá)、細(xì)胞因子的濃度區(qū)別,以及外周血中各型Treg細(xì)胞數(shù)量的差異,以探討其在原發(fā)性難治性癲癇發(fā)生及發(fā)展中的可能作用。方法本課題組自2015年11月至2017年3月在從我科建立的癲癇患者庫中耐藥性癲癇患者檔案中隨機(jī)抽取原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作患者41例,近期原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)住院患者26例作為本次研究的實(shí)驗(yàn)組,健康志愿者25例。收集受試者外周血,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,熒光抗體標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測比較原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作、原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者和健康對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25high和CD4+CD25low Treg細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的差異,以及PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowTreg淋巴細(xì)胞的表達(dá)差異,同時(shí)使用ELISA方法測定患者外周血中1L-10濃度差異,明確年齡,性別,發(fā)作程度以及病程等對(duì)上述因素的影響,確定原發(fā)性難治性癲癇患者外周血不同亞型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、IL-10及PD-1在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群百分含量的差異。結(jié)果1、健康對(duì)照組、原發(fā)性難治性癲癇復(fù)雜部分發(fā)作組、原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組三組間性別、年齡、病程、發(fā)作頻率以及CD4+CD25low T細(xì)胞百分比無顯著性差異(P0.05)。2、原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作組和癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組外周血PD-1+CD4+CD25low和PD1+CD4+CD25high Treg淋巴細(xì)胞表達(dá)的百分比明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3、原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作組和癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組外周血淋巴細(xì)胞百分比,CD4+T淋巴細(xì)胞百分比,CD4+CD25high Treg細(xì)胞百分比均明顯低于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4、癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組外周血T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD4+CD25high Treg細(xì)胞百分比均明顯低于原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作組,PD1+CD4+CD25high和PD-1+CD4+CD25low Treg細(xì)胞百分比明顯高于原發(fā)性難治性癲癇部分發(fā)作組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);5、通過ELISA法,癲癇組血清中IL-10的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組,癲癇持續(xù)狀態(tài)組明顯高于部分發(fā)作組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);6納入性別、年齡、病程和發(fā)作頻率與各結(jié)果相關(guān)性(spearman相關(guān))分析,提示僅癲癇部分發(fā)作外周血組隨患者年齡PD1+CD4+CD25low T細(xì)胞中的百分比、CD4+T細(xì)胞的百分比(P2)表達(dá)下降,存在相關(guān)性(P0.05);健康對(duì)照組與癲癇持續(xù)發(fā)作組的年齡與各結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性;7對(duì)PD1+CD4+CD25high Treg/CD4+CD25highTreg比率進(jìn)行相關(guān)性分析,三組兩兩比較,提示癲癇患者中上述比率明顯增高,且隨發(fā)作程度增強(qiáng)比率上升,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論原發(fā)性難治性癲癇不同發(fā)作程度組患者PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25low Treg細(xì)胞上表達(dá)和IL-10濃度都明顯升高,同時(shí)CD4+T細(xì)胞群失調(diào),PD-1+CD4+CD25highTreg/CD4+CD25high Treg比例發(fā)生改變。我們的研究結(jié)果表明在人類原發(fā)性難治性癲癇患者中,PD-1的表達(dá)增高很可能與患者體內(nèi)自身免疫反應(yīng)過程相關(guān),該路徑參與了原發(fā)性難治性癲癇病變過程中自身免疫調(diào)控。因此我們推測PD-1免疫通路的改變,導(dǎo)致系統(tǒng)性免疫狀態(tài)和炎性環(huán)境的變化,T細(xì)胞表型和炎癥因子分泌水平紊亂,引起自身免疫,最終導(dǎo)致原發(fā)性難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展以及耐藥的發(fā)生。第二部分負(fù)性協(xié)調(diào)刺激分子PD-1在原發(fā)性難治性癲癇患者中樞免疫調(diào)控的研究目的腦脊液與腦組織細(xì)胞外液直接相連,不同部位腦組織的代謝產(chǎn)物均可分泌進(jìn)入腦脊液,神經(jīng)元缺失、損傷以及突觸受損、血腦屏障破壞等都會(huì)引起腦脊液中蛋白質(zhì)以及細(xì)胞因子等特異性改變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)常僅反映于腦脊液中,腦脊液免疫細(xì)胞成分的分析便成為評(píng)價(jià)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能的重要途徑,因此腦脊液具有重要的臨床研究價(jià)值。我們通過體外實(shí)驗(yàn)測定原發(fā)性難治性癲癇患者腦脊液中淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比以及PD-1在Treg淋巴細(xì)胞的表達(dá)和IL-10的濃度,比較原發(fā)性難治性癲癇癲癇持續(xù)狀態(tài)患者和健康志愿者腦脊液中IL-10和PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴細(xì)胞的表達(dá)的差異,探討其在中樞性免疫的作用。方法本課題組自2015年11月至2017年3月在從我科原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)住院患者26例作為本次研究的實(shí)驗(yàn)組,健康志愿者25例。收集受試者腦脊液,分離腦脊液中單個(gè)核細(xì)胞,RPMI1640中培養(yǎng)以行T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增,免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測并比較原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者和健康志愿者腦脊液中PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowT淋巴細(xì)胞的表達(dá),ELISA方法測定腦脊液中IL-10的濃度,明確各實(shí)驗(yàn)組PD-1在CD4+CD25high,CD4+CD25low Treg細(xì)胞,PD1+CD4+CD25high在CD4+CD25highT細(xì)胞的百分比含量的差異,明確年齡,性別和病程等對(duì)上述因素的影響,確定并比較原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者和健康志愿者腦脊液中PD-1、Treg細(xì)胞和IL-10間的免疫相關(guān)關(guān)系。結(jié)果1健康對(duì)照組、原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組兩組間性別、年齡、病程、發(fā)作頻率以及CD4+CD25low T細(xì)胞百分比,CD4+T淋巴細(xì)胞百分比無顯著性差異(P0.05)。2原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組腦脊液中PD-1在CD4+CD25low和CD4+CD25high Treg淋巴細(xì)胞表達(dá)的百分比明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者組腦脊液中淋巴細(xì)胞百分比,PD-1+CD4+CD25high Treg細(xì)胞百分比明顯高于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4通過ELISA法,癲癇持續(xù)狀態(tài)組腦脊液中IL-10的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 PD1+CD4+CD25high Treg/CD4+CD25high Treg比率進(jìn)行相關(guān)性分析,兩組進(jìn)行比較提示癲癇持續(xù)狀態(tài)組與健康對(duì)照組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論我們推測原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者中CD4+CD25+T細(xì)胞上其PD-1表達(dá)上調(diào)后一方面抑制了T細(xì)胞的正常增殖,從而CD4+CD25+high Treg的數(shù)量減少,另一方面抑制了CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。由于CD4+CD25+Treg數(shù)量及功能降低,從而對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制能力不足,進(jìn)而增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞活性,誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫平衡紊亂,增加免疫病理損傷,導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。綜上所述,CD4+CD25highTreg數(shù)量下降及其表達(dá)PD-1分子上調(diào)導(dǎo)致進(jìn)一步降低Treg的免疫抑制活性,可能在原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)中樞免疫機(jī)制中起了重要作用。第三部分丙戊酸對(duì)負(fù)性協(xié)調(diào)刺激分子PD-1在原發(fā)性難治性癲癇患者免疫調(diào)控的影響及作用目的癲癇的反復(fù)發(fā)作及慢性病程均導(dǎo)致了免疫狀態(tài)的改變,免疫介導(dǎo)的癲癇發(fā)病機(jī)制可能導(dǎo)致了難治性癲癇耐藥的可能,丙戊酸可能通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的能力來介導(dǎo)不同的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)來差異調(diào)節(jié)炎癥,并且它們可以為治療炎癥相關(guān)疾病提供互補(bǔ)的免疫調(diào)節(jié)作用。因此我們通過體外實(shí)驗(yàn)確定原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)丙戊酸控制發(fā)作前后患者外周血中PD-1在CD4+CD25high和CD4+CD25lowTreg淋巴細(xì)胞和IL-10的表達(dá)差異,比較癲癇持續(xù)狀態(tài)控制前(d0)后(d3)丙戊酸濃度與癲癇控制臨床作用間的關(guān)系,并探討其在原發(fā)性難治性癲癇治療過程中的免疫作用。方法本課題組自2015年11月至2017年3月在從我科原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)住院患者26例作為本次研究的實(shí)驗(yàn)組,健康志愿者25例。使用丙戊酸作為癲癇干預(yù)治療唯一因素,癲癇持續(xù)狀態(tài)控制前(d0)后(d3)不同時(shí)段收集受試者外周血和腦脊液,HPLC方法測定外周血及腦脊液中丙戊酸鈉血藥濃度,免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測PD-1在CD4+CD25high,CD4+CD25low調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量,PD1+CD4+CD25high/CD4+CD25high Treg細(xì)胞比率,ELISA法測定IL-10的血漿濃度,比較丙戊酸干預(yù)處理前后上述指標(biāo)的變化,丙戊酸濃度與臨床癲癇治療的相關(guān)性,明確年齡,性別以及病程等對(duì)上述因素的影響。結(jié)果1.原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者丙戊酸控制癲癇治療48h后(d3組)中PD-1+CD4+CD25low和PD-1+CD4+CD25high Treg淋巴細(xì)胞表達(dá)的百分比,以及CD4+T細(xì)胞百分比明顯低于癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作初期24h內(nèi)(d0組),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而CD4+CD25low和CD4+CD25high,淋巴細(xì)胞百分比和CD4+T淋巴細(xì)胞百分比較d0組明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.丙戊酸的血藥濃度還是腦脊液中藥物濃度高低均與癲癇持續(xù)狀態(tài)控制起始時(shí)間無明顯相關(guān)性(P0.05%),血藥濃度與腦脊液中藥物濃度無相關(guān)性,但腦脊液中藥物濃度明顯低于血藥濃度。治療過程中不同時(shí)段(d0與d3)丙戊酸血藥濃度無統(tǒng)計(jì)性差異;3.丙戊酸可調(diào)控原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)外周血中的IL-10,d3較d0明顯降低(P〈0.05);4.正常組與d0、d0與d3組間PD1+CD4+CD25high/CD4+CD25highT細(xì)胞的百分比有明顯差異(P〈0.05),正常組與d3無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論我們推測原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生時(shí)患者T細(xì)胞的正常增殖受廣泛抑制,經(jīng)積極抗癲癇持續(xù)狀態(tài)治療后PD-1對(duì)CD4+CD25+T細(xì)胞發(fā)揮免疫無能特性和免疫抑制性降低,CD4+CD25+Treg數(shù)量及功能增強(qiáng),從而抑制了機(jī)體發(fā)生免疫平衡紊亂,減輕了免疫病理損傷。綜上所述,丙戊酸抗癲癇持續(xù)狀態(tài)治療能提高CD4+CD25high Treg數(shù)量,并降低PD-1分子負(fù)性調(diào)控對(duì)Treg的免疫抑制活性,可能在原發(fā)性難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者抗癲癇持續(xù)狀態(tài)治療中免疫調(diào)控起了重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：1637949