本文選題：亨廷頓病　切入點(diǎn)：突變亨廷頓蛋白　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：亨廷頓病(Huntington's disease,HD)是一種遲發(fā)性常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病,臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知減退,病理學(xué)上以大腦皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元的大量退化、丟失為特征。HD由HD基因突變所致。HD基因第一外顯子中存在CAG三核苷酸重復(fù)序列,其編碼產(chǎn)物為亨廷頓蛋白(huntingtin, Htt)氨基末端的一段多聚谷氨酰胺片段(Poly-Q)。突變的HD基因會(huì)編碼產(chǎn)生具有超長(zhǎng)Poly-Q結(jié)構(gòu)的突變亨廷頓蛋白(mutant huntingtin,mHtt)。mHtt會(huì)被多種蛋白酶切割從而形成不同長(zhǎng)度的N末端毒性片段。mHtt的錯(cuò)誤折疊是HD神經(jīng)病理學(xué)損害的物質(zhì)基礎(chǔ),減少其形成或促進(jìn)其清除對(duì)延緩HD的病理學(xué)進(jìn)程具有重要意義。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是枸杞提取物的主要成分,具有多種生物學(xué)功能,如護(hù)肝、減輕Ⅱ型膠原蛋白引發(fā)的關(guān)節(jié)炎、提高機(jī)體免疫力、改善糖尿病中的胰島素抵抗緩解疾病進(jìn)程,以及通過阻止神經(jīng)元凋亡來減輕局灶性腦血拴所帶來的腦損傷、抵抗β樣淀粉蛋白所帶來的神經(jīng)毒性等神經(jīng)保護(hù)作用。LBP發(fā)揮這些生物學(xué)功能主要通過以下機(jī)制：如與p53信號(hào)通路相關(guān)、能激活Nrf2/HO-1抗氧化通路、通過磷酸化來激活氨基末端激酶(c-Jun of N-terminal kinase,JNK)等。其中,激活的Nrf2能幫助抵制活性氧(reactive oxygen species,ROS)所帶來的細(xì)胞損傷,并激活PI3K-AKT通路來防止細(xì)胞凋亡。AKT,又稱為蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB),屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族。AKT結(jié)構(gòu)域中含有兩個(gè)激酶催化的關(guān)鍵性磷酸化位點(diǎn)：308位上的蘇氨酸(Thr308)及473位上的絲氨酸(Ser473)。人們通常通過檢測(cè)Ser473位磷酸化來判斷AKT是否活化以及活化程度。在表達(dá)mHtt的紋狀體細(xì)胞、腦部轉(zhuǎn)染mHtt的HD大鼠模型和HD患者標(biāo)本中均有AKT活性降低；在HD細(xì)胞模型中使用AKT激活劑胰島素和IGF-1激活A(yù)KT后能抑制細(xì)胞線粒體途徑的細(xì)胞凋亡：活化的AKT能通過磷酸化Htt的Ser421位點(diǎn),減少mHtt的核內(nèi)聚集,并阻斷mHtt所引發(fā)的細(xì)胞凋亡來緩解HD病癥。因此,AKT活性降低與mHtt毒性有關(guān),增強(qiáng)AKT活性則可能減輕mHtt毒性。HD中AKT活性降低及LBP對(duì)AKT的激活作用提示LBP可能通過調(diào)節(jié)AKT活性而在HD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,因此,本研究利用穩(wěn)定表達(dá)mHtt的HD細(xì)胞模型和HD轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察了LBP對(duì)mHtt毒性的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。1.枸杞多糖降低突變亨廷頓蛋白的細(xì)胞毒性為了明確LBP對(duì)mHtt的毒性是否具有抑制作用,首先觀察了LBP對(duì)穩(wěn)定表達(dá)mHtt的HEK293細(xì)胞活力和caspase-3活性的影響。首先通過G418篩選法篩選出穩(wěn)定表達(dá)EGFP-20Q與EGFP-160Q的單克隆HEK293細(xì)胞系。用不同濃度的LBP(0.384、1.92、9.6、48、240、1200、6000或30000 μg/ml)處理穩(wěn)定表達(dá)正常Htt (20Q-Htt) HEK293細(xì)胞(HEK293-20Q細(xì)胞)或mHtt (160Q-Htt)的HEK293細(xì)胞(HEK293-160Q細(xì)胞)24 h后,CCK8法檢測(cè)顯示,0.384 jig/ml LBP即可明顯增加兩種細(xì)胞的細(xì)胞活力,隨著LBP濃度增加,細(xì)胞活力增強(qiáng)作用逐漸明顯,在9.6 μg/ml時(shí)細(xì)胞活力增加最明顯。隨著LBP濃度的進(jìn)一步增加,細(xì)胞活力不再繼續(xù)增加,至1200 p.g/ml時(shí),細(xì)胞活力反而下降,即表現(xiàn)藥物毒性。因此,以9.6μml為抑制mHtt毒性的最佳濃度。應(yīng)用酶標(biāo)法檢測(cè)caspase-3活性顯示,HEK293-160Q細(xì)胞中caspase-3的活性顯著高于HEK293-20Q細(xì)胞；9.6μg/ml LBP處理24 h后可顯著降低160Q-Htt HEK293細(xì)胞的caspase-3活性,即對(duì)mHtt的細(xì)胞凋亡毒性具有明顯的抑制作用。2.枸杞多糖使HD轉(zhuǎn)基因小鼠壽命延長(zhǎng)、體重增加、運(yùn)動(dòng)功能改善 為了明確LBP是否減輕HD轉(zhuǎn)基因小鼠中mHtt的毒性,繼而觀察了LBP對(duì)HD轉(zhuǎn)基因小鼠生存率、體重和運(yùn)動(dòng)功能影響。從小鼠第8w起進(jìn)行LBP灌胃處理至小鼠自然死亡,記錄小鼠最終自然死亡時(shí)間并用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示,蒸餾水灌胃組的TG組小鼠壽命為111.7±12.3 d, LBP灌胃的TG小鼠平均壽命為136.0±25.6 d,即LBP處理能明顯延長(zhǎng)HD轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命。對(duì)18 w各組小鼠的體重比較顯示,蒸餾水灌胃的WT小鼠和LBP灌胃的WT小鼠體重分別為24.7±2.7 g和25.7±2.8 g,蒸餾水灌胃的TG小鼠體重為17.7±0.7 g,而LBP灌胃的TG小鼠體重為22.0±1.6 g,表明LBP處理可明顯抑制TG小鼠體重的減輕。轉(zhuǎn)軸實(shí)驗(yàn)顯示,LBP處理能使HD轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的停留時(shí)間從蒸餾水灌胃的TG小鼠的25.7±3.2 s延長(zhǎng)到LBP灌胃的TG小鼠的37.0±4.6 s。步態(tài)實(shí)驗(yàn)顯示,LBP能縮短HD轉(zhuǎn)基因小鼠的步寬、減少前后爪間的重疊距離,改善步態(tài)紊亂,運(yùn)動(dòng)功能障礙得到明顯改善。上述結(jié)果說明LBP能明顯減輕HD轉(zhuǎn)基因小鼠中mHtt的毒性。3.枸杞多糖減少突變亨廷頓蛋白 因?yàn)楦咚絤Htt的存在會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生獲得性毒性,為了明確細(xì)胞毒性降低是否與mHtt有關(guān),我們檢測(cè)了LBP對(duì)mHtt的影響。首先,我們?cè)诩?xì)胞水平進(jìn)行了mHtt檢測(cè),免疫印跡和聚集物濾過陷阱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用LBP7d后,HEK293-160Q細(xì)胞中可溶型和聚集型mHtt均發(fā)生顯著性降低,但未對(duì)HEK293-20Q細(xì)胞中的Htt水平產(chǎn)生影響。RT-PCR分析顯示,LBP對(duì)與mHtt融合的GFP mRNA表達(dá)水平無明顯影響。為了明確LBP是否減少HD轉(zhuǎn)基因小鼠中的mHtt,繼而觀察了HD小鼠腦組織中mHtt的變化。免疫組織化學(xué)染色顯示,在第18w時(shí),LBP處理的TG小鼠皮質(zhì)、紋狀體和海馬中Htt免疫反應(yīng)性較未用LBP處理的TG小鼠明顯減弱；免疫印跡檢測(cè)表明,LBP處理的TG小鼠皮質(zhì)、紋狀體和海馬中聚集性和非聚集性mHtt水平均較未用LBP處理的TG小鼠明顯降低；RT-PCR分析顯示,LBP處理對(duì)TG小鼠皮質(zhì)、海馬、紋狀體中的mHtt mRNA水平無明顯影響。以上結(jié)果表明,LBP不改變mHtt的表達(dá),其減少mHtt的作用可能通過促進(jìn)mHtt降解來實(shí)現(xiàn)。4.枸杞多糖通過激活A(yù)KT活性來抑制突變亨廷頓蛋白的細(xì)胞毒性為了明確LBP是否通過減輕mHtt對(duì)AKT活性的抑制而減輕mHtt的細(xì)胞毒性,我們首先檢測(cè)了HEK293-160Q細(xì)胞和HD轉(zhuǎn)基因小鼠中LBP對(duì)AKT活性的影響。免疫印跡結(jié)果顯示,在HEK293-20Q細(xì)胞中,LBP對(duì)AKT活性沒有影響,但加入PI3K/AKT阻斷劑LY294002抑制AKT磷酸化后,發(fā)現(xiàn)LBP可減輕LY294002對(duì)AKT活性的抑制。HEK293-160Q細(xì)胞的AKT磷酸化水平低于HEK293-20Q細(xì)胞,LBP處理能使HEK293-160Q細(xì)胞中AKT活性的抑制顯著減輕,LBP對(duì)這種HEK293-160Q細(xì)胞中AKT活性抑制的減輕效應(yīng)可被LY294002明顯阻斷。我們同時(shí)對(duì)AKT的作用底物GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,LBP和／或LY294002處理后,HEK293-20Q和HEK293-160Q細(xì)胞中的GSK3p-Ser9磷酸化水平均未發(fā)生改變。對(duì)TG小鼠腦內(nèi)AKT活性檢測(cè)顯示,與WT小鼠相比,TG小鼠的皮質(zhì)、海馬、紋狀體中AKT-Ser473磷酸化顯著減少；LBP能顯著抑制TG小鼠皮質(zhì)、海馬、紋狀體中mHtt對(duì)AKT在Ser473位的磷酸化的減少。然而,使用LBP并未使WT小鼠腦中出現(xiàn)AKT活性的顯著差異,這也與我們?cè)贖EK293-20Q細(xì)胞中的檢測(cè)結(jié)果一致。我們同時(shí)也進(jìn)行了GSK3β在Ser9位的磷酸化檢測(cè),結(jié)果與細(xì)胞水平結(jié)果一致,并未出現(xiàn)差異。上述細(xì)胞和動(dòng)物水平的結(jié)果均證明,LBP能減輕mHtt對(duì)AKT活性的抑制。為了明確LBP這種減輕mHtt抑制AKT活性的作用是否與其減輕mHtt毒性的效應(yīng)有關(guān),進(jìn)一步觀察了AKT活性抑制劑LY294002對(duì)LBP減輕mHtt毒性的影響。免疫印跡及聚集物濾過陷阱分析顯示,LY294002可顯著增加HEK293-160Q細(xì)胞中可溶型和聚集型mHtt水平,并顯著抑制LBP對(duì)HEK293-160Q細(xì)胞中可溶型和聚集型mHtt水平的降低；CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)顯示,LY294002能明顯抑制LBP對(duì)mHtt降低細(xì)胞活力效應(yīng)的抑制作用,Caspase-3活性酶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,LY294002也能顯著阻斷LBP對(duì)mHtt激活caspase-3活性的抑制作用。由此表明,LBP可通過減輕mHtt對(duì)AKT活性的抑制或增加AKT活性而減少mHtt水平、減輕mHtt對(duì)細(xì)胞活力的抑制、抑制mHtt對(duì)caspase-3的激活而減輕mHtt的細(xì)胞毒性。結(jié)論：本研究證明枸杞多糖能通過增加AKT活性促進(jìn)突變亨廷頓蛋白降解,減少突變亨廷頓蛋白毒性引起的細(xì)胞活力降低和caspase-3活性升高,使HD轉(zhuǎn)基因小鼠壽命延長(zhǎng)、體重增加、運(yùn)動(dòng)功能改善,由此為枸杞多糖作為治療HD或控制HD進(jìn)展的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：1636748