本文選題：TUBB3　切入點：顳葉癲癇　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分TUBB3在難治性癲癇患者及動物模型中的表達目的:檢測TUBB3在難治性癲癇患者及兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中的表達情況。方法:1.從課楲組建立的由300多例難治性TLE患者術后腦組織組成的腦庫中隨機抽取癲癇腦組織標本(實驗組)30例,非癲癇腦外傷患者腦組織(顳葉皮質(zhì))標本作為對照組10例。2.成年雄性SD大鼠(體重220±20g,7-8周齡),氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),構建SE后慢性TLE模型,分為有自發(fā)性反復癲癇發(fā)作組(SRS,6w,n=8)和無自發(fā)性反復癲癇發(fā)作組(non-SRS,6w,n=8)。3.構建戊四氮(PTZ)慢性點燃大鼠模型,分為點燃成功組(n=8)和未點燃成功組(n=8)。4.用免疫印跡方法檢測TUBB3表達情況,免疫熒光檢測TUBB3表達部位。結果:1.難治性TLE患者術后腦組織及對照腦組織中均有TUBB3表達,且TUBB3在癲癇患者術后腦組織中表達較對照組顯著增高(★p0.05)。2.在氯化鋰-匹羅卡品誘導的慢性癲癇大鼠模型中,有自發(fā)性發(fā)作的大鼠皮質(zhì)和海馬tubb3表達水平均較無自發(fā)性發(fā)作組明顯增高(★★★p0.001,#p0.05);ptz慢性點燃模型中,點燃成功組大鼠皮質(zhì)和海馬tubb3表達水平均較未點燃組顯著增高(★p0.05,##p0.01)。3.癲癇患者腦組織中免疫熒光顯示tubb3免疫反應陽性細胞有較長突起,主要在神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突初段表達,且與抑制性神經(jīng)元標記物(gad67)和成熟的抑制性突觸標記物(gephyrin)共表達,與興奮性突觸標記物(psd95)無共表達;并在慢性癲癇大鼠模型腦組織中得到驗證。結論:難治性tle患者和兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中tubb3表達均明顯增加,且tubb3與抑制性突觸共表達,提示tubb3可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。第二部分tubb3對兩種癲癇動物模型行為學的影響目的:為進一步探討tubb3在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用,我們構建了tubb3-shrna和tubb3過表達基因的腺相關病毒(aav)載體,通過海馬立體定位注射改變大鼠海馬tubb3表達,觀察tubb3對ptz慢性點燃模型和匹羅卡品慢性癲癇模型行為學的影響。方法:1.構建攜帶有tubb3-shrna和tubb3過表達基因的腺相關病毒載體。2.成年雄性sd大鼠隨機分為三組:海馬立體定位注射腺相關病毒空載體組(aav-gfp);腺相關病毒tubb3-shrna組(aav-tubb3-shrna);腺相關病毒tubb3過表達組(aav-tubb3)。3.分別用免疫熒光、免疫印跡技術檢測轉(zhuǎn)染效率。4.ptz慢性點燃模型行為學觀察:在沉默tubb3和過表達tubb3的癲癇模型中,我們利用閾下劑量ptz,每隔48h進行1次,觀察點燃過程中各時間點平均發(fā)作分級。5.氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型行為學觀察:在沉默tubb3和過表達tubb3的癲癇模型中,造模后持續(xù)視頻監(jiān)測大鼠srs情況。統(tǒng)計srs次數(shù)和用racine評分評估發(fā)作的嚴重程度。結果:1.aav-tubb3-shrna、aav-tubb3和aav-gfp海馬立體定位注射后,免疫熒光結果顯示海馬ca1和齒狀回均有gfp陽性表達。免疫印跡結果顯示,與相應時間點對照組相比,tubb3-shrna組od值在病毒注射后第3周和第9周顯著降低(★★p0.01),tubb3過表達組od值在病毒注射后第3周和第9周顯著增加(★★p0.01)。2.ptz慢性點燃過程中,與對照組相比,tubb3-shrna組各時間點平均發(fā)作分級顯著降低,tubb3過表達組各時間點平均發(fā)作分級顯著升高(★p0.05,★★p0.01)。3.氯化鋰-匹羅卡品誘導的se后慢性期內(nèi)(3-6w),與對照組相比,tubb3-shrna組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級發(fā)作比例顯著降低,tubb3過表達組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級發(fā)作比例顯著升高(★p0.05,★★p0.01,★★★p0.001)。結論:1.腺相關病毒tubb3-shrna或tubb3過表達海馬立體定位注射后可顯著改變海馬tubb3的表達,轉(zhuǎn)染在注射后3周有效,可持續(xù)至9周。2.腺相關病毒介導的海馬tubb3-shrna能減輕ptz慢性點燃過程中各時間點平均發(fā)作分級,tubb3過表達產(chǎn)生相反的結果。3.腺相關病毒介導的海馬tubb3-shrna能減少氯化鋰-匹羅卡品誘導的慢性期自發(fā)性發(fā)作的次數(shù)并減輕發(fā)作嚴重程度,tubb3過表達產(chǎn)生相反的結果。第三部分tubb3在癲癇發(fā)作中的作用機制目的:探討tubb3對點燃動物神經(jīng)元抑制功能的影響及其可能的潛在機制。方法:1.取25只成年雄性清潔級sd大鼠,根據(jù)海馬內(nèi)立體定位注射試劑不同分為三組:aav-tubb3-sh組、aav-tubb3組和aav-gfp組。2.三周后構建ptz慢性點燃大鼠模型,取材制作海馬腦片。采用全細胞膜片鉗技術檢測各組海馬ca1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流(mipsc)和成對脈沖比例(ppr)的變化情況。3.免疫印跡法檢測ptz慢性點燃成功后大鼠海馬gaba-a受體β2/3的總蛋白和膜蛋白表達情況。4.免疫共沉淀檢測PTZ慢性點燃成功后大鼠海馬中TUBB3、GABARAP和GABA-A受體β2/3三者相互作用情況。結果:1.全細胞膜片鉗技術對CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄結果顯示,與對照組相比,TUBB3-shRNA組中m IPSC幅度顯著增高(★P0.05);TUBB3過表達產(chǎn)生了相反的效果;mIPSC頻率在TUBB3-shRNA組與GFP組之間無顯著性差異(P0.05);TUBB3-shRNA組與GFP組相比,PPR無顯著性差異(P0.05)。2.免疫印跡結果顯示,TUBB3-shRNA組GABA-A受體β2/3膜蛋白/總蛋白比值顯著增加(★P0.05),TUBB3過表達組膜蛋白/總蛋白比值明顯降低(★P0.05);GABA-A受體總蛋白表達量無顯著變化(P0.05);GluR2/3無顯著性差異(P0.05)。3.免疫共沉淀結果顯示癲癇大鼠海馬組織中內(nèi)源性TUBB3和內(nèi)源性GABARAP、GABA-A受體三者相互作用。結論:1.癲癇大鼠海馬中下調(diào)TUBB3能顯著增加海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的mIPSC幅度。2.癲癇狀態(tài)下,TUBB3能與GABARAP相互作用選擇性影響突觸后GABA-A受體依賴性抑制性突觸后電流。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1

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