本文選題：神經(jīng)酰胺　切入點：多發(fā)性硬化癥　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)是一種伴隨著神經(jīng)細胞死亡,髓鞘脫落的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,患者常出現(xiàn)幻視及認知障礙等臨床癥狀。MS的發(fā)病機制尚不明確,目前大多數(shù)研究者認為MS的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同影響的結果。MS的臨床治療藥物仍停留在免疫調(diào)節(jié)劑及免疫抑制劑階段,但均療效有限且存在嚴重的副作用。維生素D(Vitamin D,VD)作為人體內(nèi)必需的微量有機物質(zhì),主要在調(diào)節(jié)人體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。近年來,VD在免疫系統(tǒng)疾病及癌癥治療方面的作用逐漸受到關注。流行病學調(diào)查顯示,MS發(fā)病率與光照有顯著相關性。光照可催化體內(nèi)VD合成,科學家們推測MS與VD具有相關性。隨后的研究發(fā)現(xiàn),MS病人體內(nèi),維生素D的含量明顯降低,且維生素D的缺乏可增加MS的患病風險。進一步研究發(fā)現(xiàn),在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)動物模型實驗中,補充維生素D能顯著緩解模型動物的EAE癥狀。目前關于維生素D緩解MS/EAE的作用研究已有些報道,但其具體作用機制仍不甚明確。因此,深入探討維生素D緩解MS/EAE作用機制,可為維生素D的臨床應用提供必要的實驗依據(jù),具有重要的理論和實踐意義。一,PC12細胞中維生素D對神經(jīng)酰胺的影響作用研究鞘脂是一類參與到多種生物學功能和病理學過程中的脂類物質(zhì)。神經(jīng)酰胺(Ceramide,Cer)作為鞘脂類的中心代謝產(chǎn)物參與多種細胞活動,如細胞遷移,凋亡過程及炎癥反應。短鏈神經(jīng)酰胺及內(nèi)源性神經(jīng)酰胺能夠促進PC12細胞的凋亡,主要表現(xiàn)為促進細胞核的破碎和核內(nèi)DNA的損傷。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠的脊髓內(nèi),C16:0-Cer的含量顯著升高,神經(jīng)酰胺合酶6的mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著升高,這表明Cer與EAE/MS的發(fā)生發(fā)展有關。本課題組的前期工作表明,維生素D能顯著降低EAE大鼠脊髓內(nèi)Cer下游代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate,S1P)的含量并緩解EAE大鼠發(fā)病進程,但是作用機制尚不明確。因此,本研究利用PC12細胞,探討維生素D對神經(jīng)酰胺的影響作用并對其作用機制進行研究,為維生素D緩解MS/EAE的作用機制研究提供細胞水平的實驗依據(jù)。目的:闡明在PC12細胞中維生素D對神經(jīng)酰胺的影響作用。為VD治療MS的機制研究提供細胞水平的實驗依據(jù)。方法:1,采用 MTT 法檢測 C2-Cer(20,10,5,2.5,1.25,0.62,0μM)處理的PC12細胞的細胞活性。2,采用HPLC-MS的方法檢測維生素D(50nM和OnM)處理的PC12細胞中C16:0-Cer的含量。3,采用RT-PCR法檢測維生素D(50nM和OnM)處理的PC12細胞中神經(jīng)酰胺合成和代謝相關酶的含量。其中包括存在于脊髓中的神經(jīng)酰胺合成相關酶,SPT(SPTLC1,SPTLC2),Cers(Cers1,Cers2,Cers3,Cers5,Cers6),以及神經(jīng)酰胺的代謝相關酶 Cerk,Smpd1-3,Sgsm1,Asah,Gba,Sms。4,采用 Western Blot 法檢測維生素 D(200,100,50,25,12.5,0nM)處理的PC12細胞中SPTLC1和Cers6的蛋白表達水平。結果:1,隨神經(jīng)酰胺(C2-Cer)刺激濃度增加PC12細胞的存活率逐漸下降,并表現(xiàn)出劑量依賴性(P***0.05)。2,在50 nM維生素D刺激后的PC12的中C16:0-Cer的含量顯著低0nM維生素D刺激后的PC12細胞(P*0.05)。說明維生素D具有降低C16:0-Cer的含量的作用。3,在50nM維生素D刺激后的PC12細胞中絲氨酸棕櫚酰轉移酶1(SPTLC1)的mRNA表達水平顯著高于0nM維生素D刺激后的PC12細胞(P***0.05)。CerS6的mRNA表達水平同樣顯著高于0nM維生素D刺激的PC12細胞(P***0.05)。4,在維生素D刺激后的PC12細胞中SPTLC1的蛋白表達隨著維生素D濃度的升高顯著降低,當維生素D濃度為50nM時SPTLC1的相對蛋白表達量達到最低水平(P***0.05)。而Cers6的蛋白表達水平顯著升高,當維生素D濃度為200nM時Cers6的相對蛋白表達量達到最高(.P***0.05)。結論:維生素D可能通過降低神經(jīng)酰胺的從頭合成的限速酶SPTLC1的蛋白表達水平來降低細胞內(nèi)C16:0-Cer的含量,從而降低神經(jīng)酰胺對PC12細胞凋亡的促進作用。因此,我們推測,在MS中,維生素D也可能通過降低神經(jīng)酰胺的促神經(jīng)細胞凋亡的作用,起到緩解MS的效果,為維生素D治療MS的機制研究提供了新思路。二,基于iTRAQ技術篩選補充維生素D前后EAE大鼠血清中的差異蛋白相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)是一種基于等重同位素標記的相對和絕對定量技術,是近年來發(fā)展迅速的定量蛋白質(zhì)組學高通量篩選技術。目的:應用iTRAQ技術,篩選誘導EAE前后及補充維生素D與未補充維生素D的EAE大鼠血清中表達差異的蛋白,篩選與EAE發(fā)病相關的血清標志物,同時,為維生素D治療MS/EAE機制提供新思路。方法:制備EAE大鼠模型,并收集血清。采用iTRAQ技術對正常(C組),EAE發(fā)病組(EAE)和補充維生素D的EAE發(fā)病組(VE)大鼠血清進行蛋白質(zhì)組學分析。1,構建EAE大鼠模型和補充維生素D:取18只大鼠平均分為三組,正常組(C組,6只),發(fā)病組(EAE組,6只),補充維生素D發(fā)病組(VE組,6只)。誘導EAE大鼠模型,應用等體積完全弗氏佐劑(CFA,含5mg/ml的百日咳疫苗)和堿性髓鞘蛋白溶液(MBP,1mg/ml)混合液注射Lewis大鼠雙側足墊,自免疫之日起,記錄大鼠體重及評分情況。免疫發(fā)病后,處死大鼠,取大鼠心臟全血,離心取血清。2,iTRAQ篩選EAE誘導前后及維生素D補充前后大鼠血清中差異表達的蛋白:每組中每三只大鼠血清混合為一個樣品池,去除血清中高豐度蛋白后定量,酶解獲得肽段。利用同位素標記肽段,SCX分級隨后進行梯度Q-exactive分析,共計15次LC-MS/MS分析。得到原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)后通過Proteome Discoverer分析軟件檢索數(shù)據(jù)庫獲得差異表達蛋白。3,篩選C組與E組大鼠血清中表達差異的蛋白及VE組與E組大鼠血清中表達差異的蛋白。4,通過GO功能注釋和KEGG通路分析等生物信息學方法分析差異蛋白的功能屬性及作用通路。結果:1,成功構建EAE大鼠模型。2,按照P-value小于0.05且表達差異倍數(shù)大于1.2倍的標準,篩選差異表達的蛋白。E組與C組相比,篩選出74種具有差異表達的蛋白,其中上調(diào)的蛋白42種,下調(diào)的蛋白32種;VE組與E組相比,篩選出80種差異表達的蛋白,其中上調(diào)蛋白40種,下調(diào)蛋白40種。其中E/C和VE/E中表達均變化的蛋白有20種。3,生物信息學分析表達差異蛋白的功能及作用通路。4,選擇 Proterin S100-A8 和 Interleukin 1 receptor antagonist 作為候選蛋白。它們不僅與EAE的發(fā)病相關而且能在維生素D的作用時下調(diào)。結論:本實驗首次將定量蛋白質(zhì)組學技術應用于EAE鼠血清中篩選差異表達的蛋白。我們篩選出了 74種在EAE鼠與正常鼠血清中的表達差異的蛋白,為EAE發(fā)病機制的研究提供了精確定量組學數(shù)據(jù);我們還篩選出了 80種補充VD的EAE大鼠與不補充VD的EAE大鼠血清中的差異蛋白,為VD治療MS的作用機制研究提供了新的突破點。通過對目標蛋白的分析,篩選出與脊髓損傷有關的蛋白如:Proterin S100-A8 和與 MS 發(fā)病相關的蛋白 Interleukin 1 receptor antagonist等,為進一步深入研究VD治療MS的作用機制提供了新靶點和突破口。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R744.51

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