本文選題：自噬　切入點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：多發(fā)性硬化（multiple sclerosis, MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）自動免疫性疾病，神經(jīng)退行性變與炎性脫髓鞘均為其重要病理特征。多發(fā)性硬化疾病早期階段開始出現(xiàn)神經(jīng)元退行性變，是多發(fā)性硬化病人神經(jīng)功能持續(xù)、進(jìn)行性損害的主要原因。多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的病理機(jī)制迄今未明，與炎癥、氧化應(yīng)激、軸漿內(nèi)Ca2+聚集、谷氨酸興奮毒性、線粒體失功能、蛋白聚集和碳素化等多種機(jī)制有關(guān)。 自噬是將細(xì)胞內(nèi)多余或受損的細(xì)胞器、折疊蛋白和侵入的病原體運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行消化降解的通路。自噬對T細(xì)胞具有前存活和前死亡雙重作用，是免疫和炎癥重要介導(dǎo)者。同時，自噬在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，如阿爾茨海默病、Huntington’s病、帕金森氏病和肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)。最近實(shí)驗(yàn)研究顯示，多發(fā)性硬化病人和EAE小鼠T細(xì)胞及腦組織自噬相關(guān)基因5（autophagyassociated gene, Atg5）水平明顯升高，這提示自噬與多發(fā)性硬化病理存在某種特定的聯(lián)系。但是，自噬在多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性病變的作用未見相關(guān)報道。 目前認(rèn)為，調(diào)節(jié)自噬活性是神經(jīng)退行性疾病潛在且頗具前景的治療手段。雷帕霉素是哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target ofrapamycin, mTOR）抑制劑和最為經(jīng)典的自噬藥理誘導(dǎo)劑,經(jīng)證實(shí)可以有效緩解多發(fā)性硬化病人和EAE模型小鼠病情，然而是否減輕神經(jīng)元退行性變未見相關(guān)報道。目前多發(fā)性硬化的治療主要是針對抗炎和免疫調(diào)節(jié)，這些治療可以有效緩解多發(fā)性硬化急性期病情，但不能改善繼發(fā)的長期進(jìn)行性神經(jīng)功能缺失。深入研究自噬在多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的發(fā)病機(jī)制為制定新的有效治療策略奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎小鼠模型(Experimental autoimmuneencephalomyelitis, EAE)是研究多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的理想模型。本實(shí)驗(yàn)觀察自噬活性的時序表達(dá)和調(diào)節(jié)通路的活性改變，以及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素在EAE神經(jīng)元損傷的效果，旨在初步探討自噬與多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性變發(fā)病機(jī)制中的可能聯(lián)系，為多發(fā)性硬化治療尋找新靶點(diǎn)。 方法： 1實(shí)驗(yàn)材料 雌性C57BL/6純系小鼠，鼠齡6-8周，體重18-20g，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（北京，中國）。小鼠飼養(yǎng)于室溫(24士2℃)無菌環(huán)境中，維持光與暗12小時交替循環(huán)，提供足夠的食物和潔凈水。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會和當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。 2EAE模型的建立和評價 將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5mg/ml，并按1∶1等體積加入CFA，加入結(jié)核桿菌H37Ra使其終濃度為4mg/ml，充分混合乳化。乳化后按每只0.1ml于C57BL/6小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射，第0h及第48h腹腔注射0.5ml PTX（500ng/只）。免疫當(dāng)天起采用國際通用的5分制法對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分無癥狀；1分尾部失去張力；2分后肢力弱；3分后肢癱瘓；4分后肢及前肢癱瘓；5分瀕臨死亡或死亡。當(dāng)臨床癥狀介于兩個評分之間時以較低分?jǐn)?shù)加0.5分表示。 3實(shí)驗(yàn)分組及治療 為了研究EAE小鼠脊髓自噬活性的時序變化，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的兩組：空白對照組和EAE模型組。每組又根據(jù)免疫后不同時期分成鼠齡匹配的三個亞組：發(fā)病前期組（13天）、發(fā)病高峰期組（20天）和發(fā)病晚期組(30d)。 為了研究自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對EAE小鼠神經(jīng)元的影響，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的三組：空白對照組（Control）、實(shí)驗(yàn)對照組（EAE-Vehicle）、雷帕霉素治療組(EAE-Rapamycin)。雷帕霉素治療組自免疫當(dāng)日起腹腔注射雷帕霉素(Sigma)(1mg/kg)，每日一次。實(shí)驗(yàn)對照組小鼠自免疫當(dāng)日起每日腹腔注射等量的滅菌水，每日一次。治療至疾病高峰期處死小鼠。 4自噬流分析 為了分析EAE小鼠脊髓自噬流導(dǎo)向，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的4組：空白對照組（正常小鼠+溶劑）、氯喹組（正常小鼠+氯喹）、EAE模型對照組（EAE模型小鼠+溶劑）、氯喹-EAE模型治療組（EAE模型小鼠+氯喹）。每個亞組各5只小鼠。各組小鼠自EAE發(fā)病起（臨床癥狀≥1.0）腹腔注射溶劑（0.1ml生理鹽水）或氯喹(Sigma-Aldrich, Milano, Italy)(60mg/kg)，每日一次，連續(xù)給藥7天。通過比較氯喹存在和缺失情況下LC3-II蛋白水平的不同來確定EAE小鼠脊髓自噬流導(dǎo)向。 5Nissl染色 免疫后第17-21天，每組各取5只小鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌流，取脊髓腰骶段石蠟包埋,5μm連續(xù)切片，進(jìn)行Nissl染色和TUNEL染色。切片脫蠟至水后依次經(jīng)過焦油堅(jiān)牢紫水溶液浸染，蒸餾水沖洗，95%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片保存。按照下列標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目：（1）位于脊髓前角腹側(cè)至中央管腹側(cè)末端連線之間區(qū)域的神經(jīng)元；（2）20微米或以上直徑的神經(jīng)元;和（3）不同的核仁神經(jīng)元。 6免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡 免疫后20d的腰髓標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后制作成厚度為30um的冰凍切片。切片用0.01M PBS清洗，5分鐘×3次。切片用0.01M PBS清洗，10分鐘×3次。接下來用0.3%Triton X-100打孔約20分鐘，之后用10%馬血清封閉1小時，再浸在加有相應(yīng)一抗的96孔板中孵育，4℃搖床過夜。次日，用0.01M PBS洗5分鐘×3次，之后避光浸于已加入相應(yīng)二抗的96孔板中孵育1小時，再次0.01M PBS洗3次，蒸餾水中浸泡數(shù)秒鐘，放于擦凈的載玻片上，避光晾干，之后滴一滴淬滅劑，封片。 7TUNEL染色 神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）(Roche, Mannheim, Germany)測定。參照TUNEL試劑盒說明書，脊髓組織切片經(jīng)過TUNEL反應(yīng)液、Alexa fluor568-共軛-鬼筆環(huán)肽、DAPI染色。組織切片在Olympus顯微鏡（Olympus BX51，Tokyo, Japan）下觀察。計(jì)算在15隨機(jī)選擇的視野TUNEL陽性細(xì)胞核的平均值，并以視野內(nèi)標(biāo)記的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)表示。 8Western blot分析 從脊髓腰膨大中提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣、電泳，濃縮膠：80V；分離膠：100V，直到所需marker條帶跑完后停止電泳。電泳結(jié)束后使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃100V恒壓條件下電轉(zhuǎn)120min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜1h。一抗孵育：封閉液稀釋p-AKT、ATK、p-p70S6K、p70S6K、LC3-II、Beclin1、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體，與封閉好的PVDF膜4℃過夜。二抗孵育：用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗，室溫下孵育PVDF膜2h。加ECL、曝光、顯影、定影。 9統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)；臨床神經(jīng)功能評分資料應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；其余計(jì)量資料均數(shù)的兩組間比較應(yīng)用ANOVA方差分析。p 0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1與空白對照組對比，C57BL/6小鼠脊髓LC3-II蛋白水平在免疫后各個時間點(diǎn)（13天、20天、30天）均上調(diào)，免疫后20天最為顯著，30天時降低。EAE小鼠脊髓Beclin1蛋白水平的時序變化與LC3-II相反。與空白對照組比較，免疫后13天EAE小鼠脊髓Beclin1蛋白水平下調(diào)，免疫后20天降至最低點(diǎn)，免疫后30天回升至空白對照組水平。 疾病高峰期（約免疫后20天作用），氯喹-空白對照組與溶劑-空白對照組相比，小鼠脊髓LC3-II水平升高。而EAE-溶劑對照組和EAE-氯喹治療組LC3-II水平無顯著差異。 2在疾病高峰期，EAE小鼠腰膨大節(jié)段，LC3主要定位于神經(jīng)元，其次為少突膠質(zhì)細(xì)胞，很少定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。與鼠齡匹配的正常對照組相比，EAE小鼠LC3與NeuN熒光共定位現(xiàn)象明顯增多。 3免疫后13天EAE小鼠脊髓p-Akt (Ser473)水平輕度減少，免疫后20天其磷酸化水平明顯升高，免疫后30天有所回落。p-p70S6K (Thr389)時序性變化與p-Akt水平基本一致。而總Akt和p70S6K無顯著改變。雷帕霉素治療導(dǎo)致EAE小鼠脊髓LC3-II蛋白水平以及Beclin1蛋白水平顯著增加，磷酸化Akt和p70S6K水平降低。 4雷帕霉素治療組可以延遲小鼠疾病癥狀發(fā)生的時間，但無明顯差別。發(fā)病高峰期和發(fā)病晚期雷帕霉素均可明顯減輕神經(jīng)功能評分。與空白對照組比較，實(shí)驗(yàn)對照組和雷帕霉素治療組Nissl染色陽性神經(jīng)元數(shù)目和NeuN染色陽性神經(jīng)元數(shù)目減少。雷帕霉素治療組較實(shí)驗(yàn)對照組Nissl染色陽性神經(jīng)元和NeuN-陽性神經(jīng)元增多。 5與實(shí)驗(yàn)對照組比較，在EAE發(fā)病高峰期，雷帕霉素治療組小鼠前凋亡蛋白Bax水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平上調(diào)，Bax/Bcl-2比值上升。與空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)對照組和雷帕霉素治療組小鼠脊髓腰膨大節(jié)段TUNEL-陽性凋亡細(xì)胞明顯增多。而與實(shí)驗(yàn)對照組比較，雷帕霉素治療組脊髓腰膨大TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量略有減少，，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異。與westernblot結(jié)果一致，免疫熒光共聚焦顯示雷帕霉素治療小鼠比實(shí)驗(yàn)對照組小鼠脊髓bcl-2陽性神經(jīng)元明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。 結(jié)論： 1EAE小鼠脊髓自噬流受損導(dǎo)致自噬小體降解阻滯、聚集于神經(jīng)元，提示自噬缺陷可能是EAE小鼠神經(jīng)元退行性變的發(fā)病機(jī)制之一。 2Akt/mTOR/p70S6K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)EAE小鼠自噬活性，而雷帕霉素通過抑制該通路能夠有效恢復(fù)EAE小鼠脊髓自噬活性。 3雷帕霉素能夠明顯緩解EAE小鼠急性期神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕脊髓神經(jīng)元損傷。其原因可能與雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)神經(jīng)元聚集的蛋白質(zhì)清除，抑制Bax-依賴的凋亡、抗炎等綜合作用的結(jié)果。 4雷帕霉素即具有強(qiáng)大的抗炎、抑制免疫作用，又有神經(jīng)保護(hù)作用，是理想的治療多發(fā)性硬化的藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744.51;R512.3

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1595652