本文選題：花旗松素　切入點(diǎn)：毒死蜱　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的探討花旗松素(taxifolin,Tax)對毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)機(jī)制,為小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。方法(1)BV2細(xì)胞隨機(jī)分為4組,因CPF和Tax均為脂溶性,易溶于DMSO,故設(shè)置DMSO組為對照組:DMSO組:含0.1%DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn);CPF組:含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞,作用時(shí)間6 h;Tax組:含Tax的RPMI 1640完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn);Tax+CPF組:含100μmol/L Tax的RPMI 1640完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞,作用時(shí)間6 h;再用含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞,作用時(shí)間6 h。(2)CCK-8法檢測Tax對BV2細(xì)胞活力的影響;光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;(3)熒光染色法檢測BV2細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平;(4)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞上清TNF-α和IFN-γ蛋白表達(dá);(5)免疫熒光染色(Immunofluorescence staining,IF)檢測自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ表達(dá);(6)免疫印跡法(Western blot)檢測p-AMPK,AMPK,Nrf2,HO-1,p62蛋白表達(dá)水平以及Conpound C阻斷AMPK通路后,再次檢測上述蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)光鏡下可見CPF誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞胞體變圓,細(xì)胞突觸萎縮,且貼壁性變差,細(xì)胞聚集漂浮;Tax、Tax+CPF兩組BV2細(xì)胞形態(tài)較為靠近DMSO組,貼壁性較CPF組好,無明顯聚集現(xiàn)象。(2)熒光顯微鏡下觀察可見DMSO組綠色熒光很少且亮度較弱,CPF組綠色熒光較多且亮度增強(qiáng),而Tax和Tax+CPF靈族細(xì)胞綠色熒光減少且熒光亮度減弱。與DMSO組比較,CPF組ROS增多(P0.001),Tax、Tax+CPF組ROS無增多(P0.05);與CPF組比較,Tax、Tax+CPF組ROS降低(P0.05)。(3)ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IFN-γ水平示:與DMSO組比較,CPF、Tax+CPF兩組細(xì)胞TNF-α和IFN-γ水平升高(P?0.05),Tax組細(xì)胞TNF-α水平無升高(P0.05),IFN-γ水平升高(P?0.05);與CPF組比較,Tax和Tax+CPF組細(xì)胞TNF-α和IFN-γ的水平均有下降(P?0.05)。(4)免疫熒光染色.結(jié)果示:LC3 II主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),與DMSO組比較,CPF組細(xì)胞LC3 II在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)未見增多,Tax和Tax+CPF兩組細(xì)胞LC3 II在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增多。同時(shí),western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:與DMSO組比較,CPF組細(xì)胞p62相對表達(dá)無顯著差異(P0.05);Tax組細(xì)胞p62相對表達(dá)量增多(P?0.05),Tax+CPF組細(xì)胞p62下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:與DMSO組比較,CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無明顯改變(P0.05),Tax組AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)無顯著改變(P0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)減少,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Tax+CPF組AMPK蛋白無顯著改變,p-AMPK蛋白表達(dá)減少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著增加(P0.05);與CPF組比較,Tax組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著改變(P0.05),Tax+CPF組p-AMPK蛋白表達(dá)減少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Conpound C干預(yù)各組BV2細(xì)胞1 h后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見與DMSO組比較,CPF組AMPK蛋白表達(dá)顯著減少(P?0.05),Tax組AMPK、Nrf2蛋白表達(dá)明顯減少(P?0.05),p-AMPK、HO-1蛋白表達(dá)減少,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Tax+CPF組AMPK、p-AMPK顯著較少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著差異(P0.05);與CPF組比較,Tax組AMPK顯著升高(P?0.05),p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著差異(P0.05),Tax+CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著差異(P0.05)。結(jié)論(1)CPF對BV2細(xì)胞具有毒性作用,表現(xiàn)為BV2細(xì)胞胞體變圓,細(xì)胞突觸萎縮,且貼壁性變差,細(xì)胞聚集漂浮,BV2細(xì)胞存活率降低。同時(shí),CPF可以上調(diào)ROS、TNF-α、IFN-γ水平,誘導(dǎo)BV2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)。(2)Tax可以改善BV2細(xì)胞活力,對CPF誘導(dǎo)BV2細(xì)胞神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用;Tax下調(diào)ROS、TNF-α、IFN-γ、p62水平,上調(diào)LC3II水平,提示Tax可以減輕炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)自噬,對CPF誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞毒性發(fā)揮保護(hù)作用。(3)Tax下調(diào)p-AMPK水平,上調(diào)Nrf2、HO-1水平,提示Tax對CPF誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞毒性的保護(hù)機(jī)制可能是通過下調(diào)p-AMPK水平,激活Nrf2/HO-1信號通路實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:鐩殑鎺㈣鑺辨棗鏉劇礌(taxifolin,Tax)瀵規(guī)瘨姝昏湵(chlorpyrifos,CPF)璇卞鐨凚V2緇嗚優(yōu)紲炵粡姣掓，

本文編號：1594668