發(fā)布時間：2018-03-10 19:06

  本文選題：花旗松素　切入點：毒死蜱　出處：《新疆醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的探討花旗松素(taxifolin,Tax)對毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)誘導的BV2細胞神經毒性的保護機制,為小兒神經系統(tǒng)疾病的預防和治療提供新的思路。方法(1)BV2細胞隨機分為4組,因CPF和Tax均為脂溶性,易溶于DMSO,故設置DMSO組為對照組:DMSO組:含0.1%DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細胞,根據實驗要求設置不同時間點;CPF組:含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細胞,作用時間6 h;Tax組:含Tax的RPMI 1640完全培養(yǎng)基預處理細胞,根據實驗要求設置不同濃度、不同時間點;Tax+CPF組:含100μmol/L Tax的RPMI 1640完全培養(yǎng)基預處理細胞,作用時間6 h;再用含200μmol/L CPF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基處理細胞,作用時間6 h。(2)CCK-8法檢測Tax對BV2細胞活力的影響;光鏡下觀察細胞形態(tài)學變化;(3)熒光染色法檢測BV2細胞內活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平;(4)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞上清TNF-α和IFN-γ蛋白表達;(5)免疫熒光染色(Immunofluorescence staining,IF)檢測自噬標志性蛋白LC3Ⅱ表達;(6)免疫印跡法(Western blot)檢測p-AMPK,AMPK,Nrf2,HO-1,p62蛋白表達水平以及Conpound C阻斷AMPK通路后,再次檢測上述蛋白表達水平。結果(1)光鏡下可見CPF誘導的BV2細胞胞體變圓,細胞突觸萎縮,且貼壁性變差,細胞聚集漂浮;Tax、Tax+CPF兩組BV2細胞形態(tài)較為靠近DMSO組,貼壁性較CPF組好,無明顯聚集現(xiàn)象。(2)熒光顯微鏡下觀察可見DMSO組綠色熒光很少且亮度較弱,CPF組綠色熒光較多且亮度增強,而Tax和Tax+CPF靈族細胞綠色熒光減少且熒光亮度減弱。與DMSO組比較,CPF組ROS增多(P0.001),Tax、Tax+CPF組ROS無增多(P0.05);與CPF組比較,Tax、Tax+CPF組ROS降低(P0.05)。(3)ELISA檢測各組細胞上清液中TNF-α和IFN-γ水平示:與DMSO組比較,CPF、Tax+CPF兩組細胞TNF-α和IFN-γ水平升高(P?0.05),Tax組細胞TNF-α水平無升高(P0.05),IFN-γ水平升高(P?0.05);與CPF組比較,Tax和Tax+CPF組細胞TNF-α和IFN-γ的水平均有下降(P?0.05)。(4)免疫熒光染色.結果示:LC3 II主要在細胞質中表達,與DMSO組比較,CPF組細胞LC3 II在細胞質中表達未見增多,Tax和Tax+CPF兩組細胞LC3 II在細胞質中表達增多。同時,western blot實驗結果示:與DMSO組比較,CPF組細胞p62相對表達無顯著差異(P0.05);Tax組細胞p62相對表達量增多(P?0.05),Tax+CPF組細胞p62下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)western blot實驗結果示:與DMSO組比較,CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達無明顯改變(P0.05),Tax組AMPK、p-AMPK蛋白表達無顯著改變(P0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達減少,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),Tax+CPF組AMPK蛋白無顯著改變,p-AMPK蛋白表達減少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達無顯著增加(P0.05);與CPF組比較,Tax組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達無顯著改變(P0.05),Tax+CPF組p-AMPK蛋白表達減少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Conpound C干預各組BV2細胞1 h后,實驗結果可見與DMSO組比較,CPF組AMPK蛋白表達顯著減少(P?0.05),Tax組AMPK、Nrf2蛋白表達明顯減少(P?0.05),p-AMPK、HO-1蛋白表達減少,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),Tax+CPF組AMPK、p-AMPK顯著較少(P?0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達無顯著差異(P0.05);與CPF組比較,Tax組AMPK顯著升高(P?0.05),p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達無顯著差異(P0.05),Tax+CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達無顯著差異(P0.05)。結論(1)CPF對BV2細胞具有毒性作用,表現(xiàn)為BV2細胞胞體變圓,細胞突觸萎縮,且貼壁性變差,細胞聚集漂浮,BV2細胞存活率降低。同時,CPF可以上調ROS、TNF-α、IFN-γ水平,誘導BV2細胞發(fā)生氧化應激、炎癥反應。(2)Tax可以改善BV2細胞活力,對CPF誘導BV2細胞神經毒性具有保護作用;Tax下調ROS、TNF-α、IFN-γ、p62水平,上調LC3II水平,提示Tax可以減輕炎癥及氧化應激反應、促進自噬,對CPF誘導的BV2細胞毒性發(fā)揮保護作用。(3)Tax下調p-AMPK水平,上調Nrf2、HO-1水平,提示Tax對CPF誘導的BV2細胞毒性的保護機制可能是通過下調p-AMPK水平,激活Nrf2/HO-1信號通路實現(xiàn)。
[Abstract]:鐩殑鎺㈣鑺辨棗鏉劇礌(taxifolin,Tax)瀵規(guī)瘨姝昏湵(chlorpyrifos,CPF)璇卞鐨凚V2緇嗚優(yōu)紲炵粡姣掓，

本文編號：1594668