本文選題：腦出血　切入點(diǎn)：氧化應(yīng)激　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦血管疾病是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,發(fā)病率、致殘率、死亡率逐年增加,其中腦出血患者死亡率相對較高。老年人是腦出血的高危人群,主要危險因素包括腦動脈粥樣硬化、腦血管畸形和高血壓。目前腦出血后損傷機(jī)制尚未完全闡明,也沒有顯著改善患者預(yù)后的治療方法。腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的一個重要因素,包括較為復(fù)雜的多種機(jī)制參與,其中有氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。氧化應(yīng)激與出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在缺氧條件下,活性氧(ROS)和NO被激活,由于腦組織高氧化代謝率和較低的抗氧化水平,易受ROS誘導(dǎo),啟動線粒體調(diào)亡途徑。腦出血后大量自由基的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)/功能異常,炎性介質(zhì)引起白細(xì)胞粘附和聚集,阻塞微血管,進(jìn)一步激活白細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子,因此白細(xì)胞釋放ROS誘導(dǎo)缺血性級聯(lián)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷。核因子(NF)-κB是具有多種調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。腦出血后氧化應(yīng)激可以激活核因子(NF)-κB,誘導(dǎo)大量的炎性趨化因子、炎性介導(dǎo)細(xì)胞因子如IL-6、IL-8產(chǎn)生,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平,在細(xì)胞炎癥和凋亡中起重要作用。既往研究表明NF-κB參與腦出血的病理生理過程,其中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)毒性分子,釋放大量的游離氧和細(xì)胞因子,激活NF-κB,并參與神經(jīng)損傷和修復(fù)、炎癥和氧化應(yīng)激。C-myc具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用:在氧化應(yīng)激下,ROS激活NF-κB,啟動凋亡相關(guān)基因c-myc與Max形成二聚體,進(jìn)一步結(jié)合到DNA核心序列上以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此,本研究建立了大鼠腦出血模型,觀察了腦出血后氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性,以及凋亡相關(guān)基因c-myc的表達(dá)效應(yīng)。1實(shí)驗(yàn)動物和分組健康雄性SD大鼠(7周齡,體重220～240g)由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(證書編號SYXK-2013-0025),并飼養(yǎng)在SPF級實(shí)驗(yàn)動物房中,提供自由采食的食物和水。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組和MPEG-SOD組(每組N = 28)。采取自體血液輸注的方法建立大鼠腦出血模型,MPEG-SOD組大鼠腹腔注射MPEG-SOD。假手術(shù)組和模型組中的大鼠接受等體積的鹽水。入組大鼠用于所有實(shí)驗(yàn),所有程序均經(jīng)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。2藥物和試劑丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)購自建成生物(中國)。水合氯醛和多聚甲醛購自Kemiou Chem(中國)。兔抗NF-κ B抗體購自Boster Bio(中國)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自CST(US)。C-myc抗體購自Santa Cruz(US)。DAB染色試劑盒購自金橋(中國)。TUNEL測試試劑盒購自Roche(US)。3動物模型術(shù)前1h測量神經(jīng)功能缺損評分(NDS),以排除那些具有原發(fā)性神經(jīng)功能缺損的大鼠。腦出血模型是通過自體血液輸血產(chǎn)生的,如前所述[13]。簡言之,在手術(shù)前8小時禁食大鼠。在10%水合氯醛中麻醉后,將大鼠仰臥位固定,用腦立體定向儀固定大鼠頭部。參考大鼠腦圖譜定位尾狀核,使用微加載針將從大鼠尾部靜脈血管收集的50 μL動脈血(以25 μL/min速度)輸注到尾狀核。持續(xù)10分鐘,針緩慢縮回,用骨蠟密封鉆孔。切口無菌縫合。假手術(shù)組用同樣方法在大鼠相同位置施加等體積的鹽水。4給藥MPEG-SOD組在模型制備前20分鐘通過腹腔內(nèi)注射MPEG-SOD(100U)。假手術(shù)組和模型組給予等體積的鹽水。5動物恢復(fù)及神經(jīng)行為學(xué)評估(NDS)采用Longa的5級評分法對大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評價。大鼠從麻醉中清醒后,Longa評分Ⅱ級及以上為成功建立大鼠腦出血模型。術(shù)后12h、1d、3d和7d,采用Garcia評分法重新評估NDS,范圍為3分～18分。6 MDA和SOD水平測定和腦組織中的水含量定量手術(shù)后12h、1d、3d和7d處死大鼠,從出血側(cè)提取腦組織(N=7)。在4℃的預(yù)冷鹽水中洗滌大鼠腦組織,并在除去表面水后稱重。制備10%皮質(zhì)勻漿,離心10分鐘,收集上清液。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法定量,MDA測定采用硫代巴比妥比色法,SOD測定采用測定黃嘌呤氧化法,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行各項操作內(nèi)容,試劑盒采購于南京建成生物工程研究所。從血腫穿刺部位的后側(cè)和前側(cè)收集組織樣品(1mm3),用于計算水含量,其定義為(濕重-干重)/濕重×100%。7 HE染色大鼠用4%多聚甲醛固定,并斷頭取腦。小腦、嗅球和低位腦干都被切除,剩余的腦組織浸沒在多聚甲醛中。于前囟后1.4mm行冠狀切片。在光場顯微鏡下蘇木精-伊紅染色觀察。8免疫組織化學(xué)(IHC)染色NF-κBp65蛋白表達(dá)在所有時間點(diǎn)處死大鼠并提取已切除小腦和嗅球的腦,隨后浸沒在多聚甲醛中。制備石蠟切片(8μm)。脫蠟后,將組織切片在PBSpH7.4中漂洗三次(每次3分鐘),進(jìn)行抗原修復(fù),接著用30%H2O2孵育10分鐘以阻斷過氧化物酶的內(nèi)源性活性。加入一抗(1:1000稀釋)1小時室溫孵育,然后加入聚合物增強(qiáng)劑(20分鐘室溫孵育)。加入酶標(biāo)記的抗小鼠/兔聚合物,室溫孵育30分鐘。在顯微鏡觀察下加入新鮮制備的DAB緩沖液5分鐘。蘇木精用于復(fù)染和0.1%HCl分化。使用自來水沖洗載玻片,然后在梯度乙醇中脫水。加入二甲苯,隨后進(jìn)行樹脂安裝。使用Image-pro plus系統(tǒng)(Media Cybernetics,IPP成像分析軟件corp,US)分析在光場顯微鏡下觀察到的結(jié)果。在40X放大倍數(shù)下在血腫周圍選擇五個不同的視野,計算陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)的平均值。9 Western印跡檢測c-myc蛋白在腦組織中的表達(dá)將血腫周圍的大鼠腦組織在裂解緩沖液中裂解并通過離心收集溶液。應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過SDS-PAGE電泳(8 μ L上樣,75V 25分鐘,隨后用110V電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離凝膠底部)分離蛋白質(zhì)樣品,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(110V 45分鐘)。將膜在封閉緩沖液中封閉1小時,隨后在4℃下孵育過夜并TBST洗滌的第一抗體(1:100的抗c-myc或1:1000的抗β-肌動蛋白)孵育過夜。加入二抗(1:2000)1小時孵育。在TBST沖洗三次后,加入顯影試劑在黑暗中曝光。使用Quantity One圖像分析軟件(BioRad,US)分析彩色條帶,其相對表達(dá)式確定為目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶對內(nèi)部參照蛋白質(zhì)的吸光度值的比率。10 TUNEL測定神經(jīng)組織凋亡石蠟切片脫蠟并再水化。加入蛋白酶K在室溫下孵育,然后用H2 O2-甲醇封閉。將組織載玻片在PBS中漂洗兩次,并在中性緩沖液(室溫下1小時)中漂洗。使用過氧化氫酶室溫孵育30分鐘,隨后進(jìn)行DAB顯色和甲基綠對比染色。將組織切片脫水,并在光學(xué)顯微鏡下觀察。使用Image-pro plus系統(tǒng)(Media Cybernetics,IPP成像分析軟件corp,US)分析在光學(xué)顯微鏡(10個隨機(jī)選擇的視野,400X放大率)下觀察到的陽性細(xì)胞的總數(shù)。11統(tǒng)計方法使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先測試數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布,符合正態(tài)分布用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間比較,兩兩比較應(yīng)用LSD方法。p0.05為統(tǒng)計學(xué)有顯著差異。結(jié)果1 NDS評分假手術(shù)組中沒有觀察到大鼠肢體麻痹,并對肢體末端的疼痛刺激反應(yīng)靈敏,因此NDS評分0級。模型組和治療組大鼠均有腦血腫對側(cè)肢體麻痹,行走呈"追尾"步態(tài),兩組大鼠提取的腦組織均可見到明顯的圓形血腫。4例死于圍手術(shù)期感染或蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠及4例術(shù)后NDS評分0級大鼠均從測試隊列中剔除。腦出血的評估見圖1。假手術(shù)組中大鼠沒有發(fā)現(xiàn)明顯的行為改變。模型組大鼠神經(jīng)功能缺陷明顯,且術(shù)后3dNDS評分最高。與模型組相比,MPEG-SOD組大鼠在術(shù)后12h、1d、3d和7d的NDS評分均差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05,圖2)。2手術(shù)后腦組織水腫假手術(shù)組大鼠腦組織沒有觀察到明顯的水腫。模型組大鼠術(shù)后有腦水腫,術(shù)后3d達(dá)峰值并逐漸減輕。MPEG-SOD組與模型組相比,所有時間點(diǎn)腦水腫均明顯減輕(p0.05,圖3)。3大鼠腦組織形態(tài)HE染色和光學(xué)顯微鏡觀察,假手術(shù)組大鼠腦組織沒有觀察到明顯變化,腦組織排列規(guī)整、形態(tài)完整,細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠在所有時間點(diǎn)均觀察到腦組織不規(guī)則的神經(jīng)細(xì)胞排列,不同程度的神經(jīng)細(xì)胞腫脹,并伴有炎性細(xì)胞浸潤和膠質(zhì)增生,最嚴(yán)重的病理損傷發(fā)生在術(shù)后3d。與模型組相比,MPEG-SOD組大鼠腦組織損傷在所有時間點(diǎn)均明顯減輕(圖4)。4腦組織的MDA和SOD水平與假手術(shù)組相比,模型組大鼠在術(shù)后的所有時間點(diǎn)MDA水平均顯著升高及SOD水平均顯著降低(p0.05)。與模型組相比,MPEG-SOD組大鼠MDA水平顯著降低和SOD水平顯著升高(p0.05,圖5)。5 NF-κBp65蛋白表達(dá)檢測NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,如棕色顆粒所示。假手術(shù)組大鼠腦組織中NF-κBp65的陽性表達(dá)較少。而模型組大鼠在術(shù)后12h NF-κ Bp65陽性表達(dá)升高,3d達(dá)峰值,NF-κ Bp65陽性表達(dá)持續(xù)至術(shù)后7d。與模型組相比,MEPG-SOD組NF-κBp65陽性表達(dá)在所有時間點(diǎn)均明顯降低(圖6)。6 TUNEL神經(jīng)細(xì)胞凋亡大多數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)部,如棕黃色所示。與假手術(shù)組相比,模型組TUNEL陽性比率相對較高,在術(shù)后3d達(dá)到峰值,然后逐漸減少。MPEG-SOD組與模型組相比在所有時間點(diǎn)TUNEL陽性比率均顯著降低(圖7和圖8)。7 Western印跡檢測c-myc蛋白在腦組織中的表達(dá)在術(shù)后的所有時間點(diǎn),模型組大鼠腦組織中的c-myc蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(p0.05),模型組大鼠在術(shù)后3d腦組織c-myc蛋白表達(dá)達(dá)峰值,而MPEG-SOD組在所有時間點(diǎn)與模型組相比均具有較低的c-myc蛋白表達(dá)(p0.05,圖 9 和圖 10)。結(jié)論1、腦出血后腦組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平升高,SOD水平降低,提示腦出血后氧化應(yīng)激狀態(tài)明顯。2、腦出血后腦組織NF-κBp65蛋白術(shù)后12h表達(dá)增加,3d達(dá)峰值,術(shù)后7d,NF-κ Bp65陽性表達(dá)仍然可見。提示出血后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)NF-κ B的活化,且持續(xù)時間長,可能是繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)。c-myc蛋白的表達(dá)與TUNEL-陽性細(xì)胞數(shù)一致,術(shù)后3d達(dá)到峰值,然后逐漸減少。提示腦出血后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能與NF-κ B的活化和凋亡相關(guān)基因c-myc的啟動相關(guān)。3、抗氧化物MPEG-SOD可抑制腦出血后氧化應(yīng)激狀態(tài),降低NF-κ B及c-myc蛋白的表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,可能為減輕繼發(fā)性腦損傷提供一個新的治療思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張化彪,張?zhí)K明;腦出血模型[J];國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊;2002年06期

2 童丹;腦出血的治療進(jìn)展[J];卒中與神經(jīng)疾病;2002年01期

3 武衡,黎杏群,唐濤,黃菊芳,羅杰坤,梁清華;腦溢安對腦出血大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)的影響[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2003年05期

4 胡書超,張祥建;腦出血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制及治療策略[J];國外醫(yī)學(xué)(腦血管疾病分冊);2004年07期

5 趙和榮;;腦出血100例臨床特點(diǎn)與預(yù)防分析[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2007年08期

6 施建生;高志偉;柯開富;;腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[J];交通醫(yī)學(xué);2009年04期

7 張飛飛;陳玉英;王占祥;;腦出血干預(yù)相關(guān)因子研究進(jìn)展[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年02期

8 陳志穎;殷小平;唐洲平;;內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞與腦出血[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2013年02期

9 王復(fù)新;燕飛;畢勝;侯麗淳;王昆祥;張軍武;李培育;和梅;關(guān)雪蓮;楊慧;;大鼠腦出血微創(chuàng)后行神經(jīng)干細(xì)胞移植對其神經(jīng)功能的影響[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2013年11期

10 鄧世山,周德明;腦出血藥物治療進(jìn)展[J];四川醫(yī)學(xué);2003年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 王淑榮;;腦出血基礎(chǔ)與臨床研究的新進(jìn)展[A];2009年全國微循環(huán)與血液流變學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會專題報告及論文集[C];2009年

2 張在強(qiáng);潘樹茂;修春明;湯國太;王云波;陳鴻光;邊玉松;李新鋼;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

3 楊樹旭;錢沖;李曉斌;石磊;宋正飛;王義榮;;腦出血后神經(jīng)細(xì)胞再生的研究[A];2006年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 王玉波;吳珊;;睪酮與腦出血后肺損傷的相關(guān)性研究[A];貴州省醫(yī)學(xué)會第八屆神經(jīng)病學(xué)年會論文集[C];2010年

5 韋紅巧;李倩茗;;大鼠急性腦出血對肝臟和腎臟的影響[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)會議暨學(xué)會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

6 楊樹旭;錢聰;亓旭晨;葉紅星;方兵;李新偉;牛煥江;孫偉軍;朱先理;王義榮;;促紅細(xì)胞生成素治療腦出血的實(shí)驗(yàn)研究[A];2009年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

7 安立新;彭宇明;王保國;孫梅珍;袁芳;;停通氣缺氧預(yù)處理對腦出血大鼠炎性介質(zhì)和氧化物的影響[A];2008年中華醫(yī)學(xué)會全國麻醉學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

8 周慎;李勇敏;;癱絡(luò)通顆粒對腦出血家兔保護(hù)作用的影響[A];國家中醫(yī)藥管理局腦病重點(diǎn)研究室建設(shè)研討會暨中風(fēng)病科研成果推廣交流會論文匯編[C];2010年

9 王淑榮;劉永泉;吳曉圓;;大鼠腦出血后血腫周圍區(qū)神經(jīng)元死亡的影響因素[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

10 張禮均;鄧聰穎;孟輝;林江凱;馮華;;家犬實(shí)驗(yàn)性額葉腦出血模型的建立[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第二屆全國代表大會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 衣曉峰 秦玉文;頭針可治療急性腦出血[N];中國醫(yī)藥報;2001年

2 曾凡新 董志 傅潔民;中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶——神經(jīng)保護(hù)的作用新靶點(diǎn)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周翔;腦出血后CD47表達(dá)及其作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

2 張清華;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦出血后細(xì)胞凋亡的影響[D];山東大學(xué);2015年

3 蔡萍;重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 解文菁;CD163對腦出血血腫及灶周組織的影響變化及其機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

5 朱軍;靶向AQP4的RNAi對大鼠腦出血周圍細(xì)胞凋亡影響[D];青島大學(xué);2016年

6 陽光;鐵調(diào)素對腦出血后鐵代謝及神經(jīng)功能預(yù)后影響的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

7 陳敏;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腦出血后血腦屏障的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

8 周楷;Treg細(xì)胞通過IL-10/GSK3β/PTEN信號調(diào)節(jié)小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞極化減輕腦出血炎癥損傷[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 王春喜;沉默信息調(diào)節(jié)因子1在實(shí)驗(yàn)性腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用研究[D];南京大學(xué);2015年

10 王勇;miR-130a在腦出血后腦水腫及預(yù)后預(yù)測中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 石鑫;血腫腔內(nèi)注入神經(jīng)生長因子治療大鼠腦出血[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 趙龍;不同吸氧時間高壓氧治療對腦出血大鼠血腫周圍AQP4和SOD表達(dá)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 劉輝;硫化氫減輕腦缺血后tPA導(dǎo)致的腦出血[D];蘇州大學(xué);2015年

4 趙瑞;金屬鐵螯合劑對腦出血后大鼠腦損傷的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

5 潘文才;磁感應(yīng)相移譜技術(shù)檢測腦出血的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 張雙;單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）對大鼠腦出血后PARP-1/AIF通路影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

7 鄧婷;依達(dá)拉奉對大鼠腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3、PARP-1表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李磊;NFATc4參與腦出血后的神經(jīng)元凋亡[D];南通大學(xué);2014年

9 張海旺;環(huán)孢菌素A通過結(jié)合CypD抑制mPTP開放對大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血的作用及其機(jī)制研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

10 陳周青;膜聯(lián)蛋白Annexin1對大鼠腦出血后血腦屏障損傷保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2016年

，

本文編號：1585609