本文選題：阿爾茨海默病　切入點(diǎn)：膽堿能神經(jīng)元　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分背景阿爾茨海默病是一種慢性的退行性病變。由于其發(fā)病隱匿,進(jìn)展緩慢,臨床癥狀以各種失能為主并且難以治療,已經(jīng)成為了威脅老年人健康的第二大疾病。因此,有效的治療阿爾茨海默病是全人類所面對(duì)的一個(gè)重大議題。目前,人們對(duì)于阿爾茨海默病的病理機(jī)制的了解仍不完善,而治療阿爾茨海默病的藥物大部分仍舊停留在對(duì)癥支持治療的階段。美國(guó)FDA批準(zhǔn)的有效治療阿爾茨海默病的5類藥物中,有4類都為膽堿酯酶抑制劑,并且只能針對(duì)輕到中度的阿爾茨海默病,對(duì)重度的阿爾茨海默病基本無(wú)效,因此從探討新的治療阿爾茨海默病的手段和方法來(lái)減緩或者治愈腦部的這種退行性病變極為重要。乙酰膽堿,作為最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì),在阿爾茨海默病的病理機(jī)制中起著極為重要的作用。內(nèi)源性的乙酰膽堿在記憶的獲取、解碼、鞏固、再鞏固、消除以及恢復(fù)中都起著十分重要的作用。在阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程中,慢性的神經(jīng)退行性病變的主要特征之一就是膽堿能神經(jīng)元的丟失,但是在疾病發(fā)展的早期,膽堿能神經(jīng)元并沒(méi)有丟失,而是收縮丟掉其表型標(biāo)記物或者處于一個(gè)萎縮的狀態(tài),因此,如果能在阿爾茨海默病的早期對(duì)膽堿能神經(jīng)元進(jìn)行治療阻止其凋亡,那么也許可以挽救由于膽堿能神經(jīng)元缺失所造成行為以及記憶的異常。DAPK1是一類Ca2+/鈣調(diào)蛋白,已有研究表明,該蛋白在腦卒中的缺血再灌注損傷時(shí),可以被激活并導(dǎo)致神經(jīng)元的程序性死亡。同時(shí)DAPK1蛋白也參與了元退行性變異種的Tau蛋白的過(guò)度磷酸化,但是,在阿爾茨海默病中,DAPK1是否也介導(dǎo)了神經(jīng)元的程序性死亡,而其是如何參與Tau的過(guò)度磷酸化的機(jī)制尚不清楚。目的觀察DAPK1是否參與了阿爾茨海默病的退行性病變并探討其相關(guān)的作用機(jī)制方法本實(shí)驗(yàn)采用了3月齡的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因小鼠。使用Cre/loxp系統(tǒng)特異性的敲除轉(zhuǎn)基因小鼠膽堿能神經(jīng)元中的DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域。PCR得到轉(zhuǎn)基因均為陽(yáng)性的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠。首先使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了Cre/loxp系統(tǒng)的工作是否正常。其次對(duì)進(jìn)行了他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠以及使用玉米油的對(duì)照組進(jìn)行了礦場(chǎng)、高架十字迷宮以及水迷宮的行為學(xué)檢測(cè)。接著使用立體定位注射技術(shù)通過(guò)微量注射泵在使用他莫昔芬注射組的小鼠的雙側(cè)側(cè)腦室部位注射Aβ以制造阿爾茨海默病小鼠的模型。并設(shè)置在側(cè)腦室注射PBS的陰性對(duì)照組。對(duì)上述小鼠再次進(jìn)行礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮以及水迷宮的行為學(xué)檢測(cè)。采用電生理技術(shù),記錄上述小鼠的單個(gè)細(xì)胞的電幅度以及頻率,并記錄其LTP誘導(dǎo)和表達(dá)的水平。使用蛋白免疫印跡技術(shù)對(duì)上述小鼠腦內(nèi)的Tau及其相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。最后用高爾基染色對(duì)上述小鼠神經(jīng)元樹(shù)突上的樹(shù)突棘進(jìn)行了形態(tài)以及數(shù)目上的計(jì)算。結(jié)果經(jīng)過(guò)10天的他莫昔芬誘導(dǎo)之后,純合子轉(zhuǎn)基因小鼠中的Cre重組酶特異性的表達(dá)在了膽堿能神經(jīng)元內(nèi),并且能夠共定位。對(duì)空白對(duì)照組、注射了他莫昔芬的野生型小鼠、注射了玉米油的轉(zhuǎn)基因小鼠以及注射了他莫昔芬的轉(zhuǎn)基因小鼠的各項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。其中,礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明小鼠的運(yùn)動(dòng)能力以及一般的行為狀態(tài)、本身具有的好奇欲并沒(méi)有發(fā)生改變。高架十字迷宮顯示各組小鼠的焦慮狀態(tài)一致,他莫昔芬的注射或者轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)并沒(méi)有加深或者消除小鼠的一般焦慮。Morris水迷宮檢測(cè)顯示各組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能均一致并沒(méi)有得到損害或提高。隨后我們對(duì)注射過(guò)他莫昔芬的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠以及野生型小鼠進(jìn)行阿爾茨海默病的造模,即在其雙側(cè)側(cè)腦室注射AB,并使用PBS作為其空白對(duì)照組。通過(guò)DAB染色可以檢測(cè)到Ap確實(shí)在小鼠的海馬部位有所沉積。其后,我們對(duì)注射了他莫昔芬并雙側(cè)側(cè)腦室注射PBS的野生型小鼠、注射了他莫昔芬的雙側(cè)側(cè)腦室注射AB、注射他莫昔芬并雙側(cè)側(cè)腦室注射PBS的轉(zhuǎn)基因小鼠以及注射他莫昔芬并雙側(cè)側(cè)腦室注射Ap的四組小鼠進(jìn)行行為學(xué)的檢測(cè)。注射了Ap的野生型小鼠組其在礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中移動(dòng)的距離及站立次數(shù)減少；在高架十字實(shí)驗(yàn)中其位于閉合壁的時(shí)間延長(zhǎng)；在水迷宮實(shí)驗(yàn)中,其學(xué)習(xí)訓(xùn)練的潛伏期明顯延長(zhǎng)并且在第四天潛伏期還存在反復(fù)。而敲除了膽堿能神經(jīng)元中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠可以逆轉(zhuǎn)這些變化。說(shuō)明小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶形成了障礙。對(duì)不同組的小鼠進(jìn)行了LTP的檢測(cè)。免疫印跡顯示Ap的注射沒(méi)有引起了各組小鼠腦內(nèi)Tau的總量的改變,而是增加了磷酸化的Tau的表達(dá)量,而敲除了膽堿能神經(jīng)元中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠并沒(méi)有使Tau的磷酸化減少。最后通過(guò)高爾基染色對(duì)小鼠的樹(shù)突棘進(jìn)行觀察以及計(jì)算顯示,注射了Ap的野生型小鼠其樹(shù)突棘的形態(tài)有所改變,數(shù)量也隨之減少,敲除了膽堿能神經(jīng)元中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠的樹(shù)突棘的形狀以及數(shù)量并沒(méi)有發(fā)生太大變化。結(jié)論在轉(zhuǎn)基因小鼠中成功的誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元敲除的DAPK1蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域,可以維持由于Ap導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)元的功能損害,從而使乙酰膽堿的分泌保持正常,維持LTP的正常生理功能,使小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶功能不受到損害。第二部分背景腦卒中是一類以的腦部的血流障礙導(dǎo)致的大腦局部缺血的一類嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病。其以高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率,“三高”的特征嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康。因此尋求有效治療該疾病的藥物極為重要。在腦卒中發(fā)病后的部分病人會(huì)產(chǎn)生認(rèn)知功能的障礙,但目前并未有針對(duì)認(rèn)知功能障礙的藥物性治療,多以對(duì)癥、改善循環(huán)和康復(fù)訓(xùn)練為主。因此,研發(fā)出可以改善腦卒中后的認(rèn)知功能障礙的藥物很有意義。膽堿神經(jīng)元在大腦形成學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程中都起著極為重要的作用。大多的神經(jīng)退行性病變都與膽堿能神經(jīng)元有關(guān)。目前的研究認(rèn)為,腦卒中后的認(rèn)知功能的障礙與大腦的退行性病變以及血管的損害。因此若是在疾病的早期就針對(duì)性的對(duì)大腦的退行性病變進(jìn)行治療和干預(yù),那么就也許可以改善或者治愈腦卒中后所導(dǎo)致的認(rèn)知功能的障礙。DAPK1是一類絲氨酸/蘇氨酸Ca2+依賴型蛋白,其在腦卒中發(fā)生后可以被激活,使大量Ca2+流入細(xì)胞內(nèi),引起一系列的細(xì)胞凋亡。因此我們對(duì)膽堿能神經(jīng)元在腦卒中后的作用進(jìn)行了探討,并且特異性的敲除了DAPK1的激酶結(jié)構(gòu)域,探討該敲除是否能保護(hù)部分的膽堿能神經(jīng)元免于缺血再灌注的損傷。方法本實(shí)驗(yàn)采用了3月齡的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因小鼠。使用Cre/Ioxp系統(tǒng)特異性的敲除轉(zhuǎn)基因小鼠膽堿能神經(jīng)元中的DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域。PCR得到轉(zhuǎn)基因均為陽(yáng)性的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)各組小鼠進(jìn)行了大腦中動(dòng)脈栓塞模型,并使用TTC染色分別對(duì)術(shù)后1、3、7天的腦組織進(jìn)行了染色,使用Image J對(duì)其面積進(jìn)行分析。然后對(duì)于7天的小鼠進(jìn)行灌流并作Fluoro-Jade C和ChAT的雙重染色,觀察在梗死周邊區(qū)的膽堿能神經(jīng)元的形態(tài)以及數(shù)量是否發(fā)生變化,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果敲除了膽堿能神經(jīng)元中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠與對(duì)照組的小鼠相比,其MCAO術(shù)后1、3、7天的1缺血面積沒(méi)有顯著差異,FJ-C以及免疫熒光的雙重染色可見(jiàn),敲除了膽堿能神經(jīng)元中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域的小鼠其在缺血周圍的膽堿能神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生了變化,形態(tài)上更近似于基底前腦的膽堿能神經(jīng)元,數(shù)目相較于空白對(duì)照組也有所增加。結(jié)論特異性的敲除了DAPK1的激酶結(jié)構(gòu)域可以保護(hù)部分的膽堿能神經(jīng)元免于缺血再灌注的損傷,但不能減少缺血再灌注損傷的面積
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3;R749.16

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