本文選題：神經(jīng)膠質(zhì)瘤　切入點(diǎn)：腺病毒　出處：《寧夏醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 研究腺病毒介導(dǎo)的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)在大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)中的表達(dá)及其對大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用的機(jī)制。 方法： 1、體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)，用攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體(Adv-rHSG-GFP)轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞。根據(jù)MOI將細(xì)胞分為：A組MOI=0、B組MOI=10、C組MOI=50、D組MOI=80、E組MOI=100，，轉(zhuǎn)染Adv-rHSG-GFP24h后分別收集每組細(xì)胞，采用Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測rHSG蛋白的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡觀察GFP陽性表達(dá)來評價(jià)重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞不同時(shí)間后(12h,24h,36h,48h)，同法收集細(xì)胞并檢測rHSG蛋白的表達(dá)及評價(jià)重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。 2、C6細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組、Adv-GFP轉(zhuǎn)染組和Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組，采用Western blot法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測rHSG蛋白的表達(dá)；使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，并結(jié)合MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察rHSG對細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用Western blot法檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1的蛋白表達(dá)變化； 3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實(shí)驗(yàn)觀察C6細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征以及rHSG對細(xì)胞凋亡的影響；采用Western blot法檢測過表達(dá)rHSG后PARP和cleaved caspase-3蛋白水平變化以及檢測過表達(dá)rHSG對胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor，IGF-1)誘導(dǎo)的PI3K/Akt和MAPK信號通路的影響。 結(jié)果： 1、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞24h后，rHSG蛋白的相對表達(dá)量和綠色熒光蛋白表達(dá)隨MOI值的增高而增多；用MOI為100的Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后，12h即可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，且在24h內(nèi)隨時(shí)間的變化而增高，在24-36h綠色熒光蛋白表達(dá)無變化，48h有所降低(P㩳0.01)；rHSG蛋白相對表達(dá)量在12-48h內(nèi)隨時(shí)間的變化而增高，于48h達(dá)到最大值(P㩳0.01)。 2、Adv-rHSG-GFP轉(zhuǎn)染組C6細(xì)胞中：rHSG蛋白的能夠高效表達(dá)且相對表達(dá)量均明顯高于未轉(zhuǎn)染組和Adv-GFP轉(zhuǎn)染組(P0.01)；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，且MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P0.01)；周期調(diào)控蛋白p27Kip1、p21Cip1表達(dá)升高，PCNA表達(dá)降低。 3、通過Hoechst33342/PI雙染法和彗星實(shí)驗(yàn)觀察到rHSG可以促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡和DNA損傷；Western blot法檢測結(jié)果顯示過表達(dá)rHSG后Full-length PARP于24h、72h和96h表達(dá)量明顯升高(P0.01)，而在48h明顯降低(P0.01)；cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.01)，并能夠顯著抑制IGF-1誘導(dǎo)的Akt和Erk1/2蛋白活化，且rHSG對p-Erk1/2的抑制強(qiáng)于對p-Akt的抑制。 結(jié)論： 1、攜帶有rHSG基因的重組腺病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，且在MOI值為100，24h時(shí)有最高轉(zhuǎn)染效率。 2、rHSG基因過表達(dá)能夠抑制C6細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是通過參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。 3、rHSG基因過表達(dá)能夠促進(jìn)C6細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是通過PI3K/Akt和MAPK信號通路發(fā)揮作用，并以MAPK信號通路為主。
[Abstract]:Objective:
To study the expression of adenovirus mediated rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) in rat glioma cells (C6) and its effect on proliferation and apoptosis of rat glioma cells, and to explore the mechanism of its action.
Method錛

本文編號：1575097