本文選題：膠質(zhì)瘤　切入點(diǎn)：低氧腫瘤微環(huán)境　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：人腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤,在所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中占到70%左右,其中約50%以上為惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM; WHO IV級)。手術(shù)及放化療等主要的傳統(tǒng)治療方法治愈率低,腫瘤復(fù)發(fā)率高,患者預(yù)后差。近年來,雖然顯微手術(shù)、新放化療策略、抗侵襲療法、抗血管生成療法和多種基因免疫療法在人腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤的治療研究中取得了長足進(jìn)步。但由于人腦膠質(zhì)瘤具有浸潤性生長、化療耐藥性、高侵襲性、血管生成擬態(tài)以及特殊的免疫抑制性微環(huán)境等惡性特征,上述療法在所有臨床實(shí)驗(yàn)中均未取得令人滿意的效果,患者預(yù)后尚無明顯改善,中位生存時(shí)間僅約12個(gè)月,5年生存率不足5%。因此,人們寄希望于對膠質(zhì)瘤微環(huán)境以及細(xì)胞惡性行為能力改變機(jī)制的深入揭示。其中低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的重要特征之一,參與并調(diào)控了腫瘤增殖、侵襲、血管新生及耐藥性等一系列變化。因此揭示低氧促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生長、產(chǎn)生耐藥性以及侵襲遷移能力的內(nèi)在機(jī)制,并篩選其調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn),將為改善膠質(zhì)瘤的綜合療法提供新的策略。腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment, TME)是一個(gè)具有物理低氧的多因子、多細(xì)胞的復(fù)雜環(huán)境。膠質(zhì)瘤作為一種典型的實(shí)體腫瘤,存在廣泛的低氧區(qū)域。研究證實(shí),雖然膠質(zhì)瘤血供較為豐富,但由于增殖代謝旺盛以及血管結(jié)構(gòu)功能異常,各WHO級別的人腦膠質(zhì)瘤仍存在不同程度的低氧微環(huán)境。低級別膠質(zhì)瘤(WHOⅠ級和Ⅱ級)低氧程度相對較低,其腫瘤內(nèi)低氧水平約為10%(氧分壓)。而高級別膠質(zhì)瘤低氧水平更為顯著,WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤的氧分壓約為2.5～10%,WHOⅣ級膠質(zhì)瘤的氧分壓甚至不足1%。因此,這種強(qiáng)烈的低氧分壓微環(huán)境作為重要的始動因素之一,顯著的影響著膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,并導(dǎo)致了其對放化療耐受性的提高,以及增值、侵襲和遷移等能力的改變。同時(shí),嚴(yán)重的低氧微環(huán)境也顯著改變了微環(huán)境中除膠質(zhì)瘤細(xì)胞外的其他各種細(xì)胞組分以及所分泌細(xì)胞因子的特征。microRNAs (miRs)是一類長約19-22nt的內(nèi)源性非編碼RNA,通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3'-UTR)特異性結(jié)合并導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平對基因進(jìn)行調(diào)控,在細(xì)胞增殖、凋亡、運(yùn)動等一系列生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。嚴(yán)重的低氧微環(huán)境可以顯著影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中多種miRs的表達(dá),并能通過調(diào)控相應(yīng)下游靶基因發(fā)揮重要的作用。其中與腫瘤細(xì)胞自噬和細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的多個(gè)miRs以及其上下游復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制,可能參與了低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性增殖、耐藥性的產(chǎn)生以及侵襲遷移的增強(qiáng)。自噬(Autophagy)是存在于真核生物中一種高度保守的代謝過程：通過回收細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來自我消化,滿足細(xì)胞的自身代謝需要和細(xì)胞器的再更新。這種回收能量的特殊生存機(jī)制在維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)、自我修復(fù)、逃避惡劣環(huán)境(如饑餓、低氧和毒物藥物等)等方面發(fā)揮著重要作用。而自噬作為一種新的細(xì)胞死亡機(jī)制,與凋亡之間存在密切關(guān)系,即細(xì)胞可在一定程度上通過增強(qiáng)自噬避免凋亡,以幫助細(xì)胞抵御惡劣環(huán)境。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在著廣泛的自噬激活現(xiàn)象,顯著提高了其對低氧微環(huán)境和化療藥物的耐受能力。研究證實(shí)低氧是誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬增強(qiáng)的重要因素之一,但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。此外,低氧可以顯著上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤白細(xì)胞介素6 (Interleukin-6,IL-6)的分泌,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲遷移等,但I(xiàn)L-6是否參與了低氧誘導(dǎo)的自噬上調(diào)以及相關(guān)miRs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用尚無報(bào)道。除了耐藥性,人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的高侵襲特性也是導(dǎo)致其易復(fù)發(fā)和致死亡的重要因素之一。侵襲與遷移是腫瘤的重要惡性表型,這一特性受腫瘤微環(huán)境中多種因素的調(diào)控。細(xì)胞極性(Cell Polarity)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并決定細(xì)胞侵襲和遷移的方式。研究發(fā)現(xiàn),低氧可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞極性的產(chǎn)生和增強(qiáng)并能促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移,而低氧可顯著影響調(diào)控腫瘤細(xì)胞極性的關(guān)鍵分子Rho家族GTP酶的活性。該家族的主要成員包括Rac、RhoA和Cdc42,三者相互配合并順序激活才能形成有效的細(xì)胞遷移,抑制RhoGTP酶通路的活性可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞極化和侵襲遷移障礙。越來越多研究證實(shí)miRs作為一類重要細(xì)胞內(nèi)調(diào)控分子,參與了對細(xì)胞運(yùn)動能力的調(diào)節(jié)。而低氧誘導(dǎo)的miRs促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲和遷移的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)尚不明確,需要進(jìn)一步深入研究。本課題分別從低氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬和侵襲遷移增強(qiáng)等方面,深入系統(tǒng)的探討了相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控miRs及其具體分子作用機(jī)制。首先,利用基因芯片檢測并篩選出了多個(gè)調(diào)控低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬和侵襲遷移的關(guān)鍵miRs靶點(diǎn)；然后,證實(shí)了IL-6及其下游miR-155-3p在低氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬上調(diào)中的關(guān)鍵作用,并對抗IL-6受體單克隆抗體(Tocilizumab注射液)的化療輔助療效進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)；最后,深入研究了低氧上調(diào)的miR-584-3p在調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移中的關(guān)鍵作用和具體分子機(jī)制。本課題為人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供了多個(gè)針對關(guān)鍵miRs的新靶點(diǎn),具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。第一部分低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤全基因表達(dá)譜和全microRNAs表達(dá)譜芯片檢測和潛在自噬與侵襲遷移miRs靶點(diǎn)篩選1.1目的：(1)檢測低氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤全基因組表達(dá)譜和全microRNAs表達(dá)譜的影響,進(jìn)而聯(lián)合分析兩組芯片數(shù)據(jù)并篩選與低氧下自噬增強(qiáng)和侵襲遷移變化可能相關(guān)的miRs。(2)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證并明確能夠顯著影響低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬和侵襲遷移的miRs。1.2方法：(1)低氧處理、RNA提取和基因芯片檢測將低氧處理24h的U251細(xì)胞與常氧組對照分別提取總mRNA和總microRNA,通過全基因表達(dá)譜和全microRNA表達(dá)譜的檢測,獲取詳細(xì)結(jié)果分析報(bào)告和原始數(shù)據(jù)。(2)兩組芯片數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析和靶點(diǎn)預(yù)測篩選經(jīng)檢測芯片數(shù)據(jù)及樣本同質(zhì)性均較好,使用火山圖(Volcano Plot)法篩選出低氧條件下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)量變化具有顯著性差異的基因和miR s。然后,結(jié)合全基因組表達(dá)譜芯片報(bào)告中的通路分析(P athway Analysis)和GO分析(Gene Ontology Project Analysis)結(jié)果以及大量文獻(xiàn)閱讀,將篩選出的差異性基因和miRs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,并進(jìn)行功能分類,進(jìn)一步縮小研究范圍,找出最有可能調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬和侵襲遷移的miRs。(3)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證所篩選靶點(diǎn)首先,使用多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U251、T98G、U87和A172)進(jìn)行低氧培養(yǎng),對篩選出的低氧下變化顯著的部分miRs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。然后,向低氧培養(yǎng)的U251細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的microRNA inhibitor和mimics,對通過驗(yàn)證的miRs進(jìn)行敲除和過表達(dá),分別利用Western blot法、實(shí)時(shí)定量PCR法、和Transwell法檢測上述U251細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記蛋白LC3B分子的表達(dá)水平、自噬相關(guān)miRs的表達(dá)水平、以及遷移能力變化。1.3結(jié)果：(1)低氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤全基因組表達(dá)譜和全microRNAs表達(dá)量的影響芯片共檢測已知基因位點(diǎn)25485個(gè),低氧下上調(diào)基因3104個(gè),下調(diào)240個(gè)；檢測已知microRNA位點(diǎn)2137個(gè),低氧下上調(diào)157個(gè),下調(diào)85個(gè)。低氧條件下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系的多種mRNA和miR表達(dá)量發(fā)生了顯著改變。(2)聯(lián)合分析兩組芯片數(shù)據(jù)并篩選與低氧下自噬增強(qiáng)和侵襲遷移變化可能相關(guān)的miRs箱圖、散點(diǎn)圖及聚類分析結(jié)果均顯示該芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,而火山圖篩選出2倍以上變化的顯著性差異表達(dá)的基因和miRs數(shù)目明顯減少：其中基因有304個(gè),其中上調(diào)242個(gè),下調(diào)62個(gè)；而miRs有84個(gè),其中上調(diào)67個(gè),下調(diào)17個(gè)。然后根據(jù)變化倍數(shù)對上述靶點(diǎn)進(jìn)行由大到小排序。對上述差異表達(dá)的基因進(jìn)行Pathway分析發(fā)現(xiàn),富集值較高的通路共6條,其中上調(diào)5條,下調(diào)1條。而GO分析篩選出上調(diào)GO條目218條,下調(diào)GO條目87條。結(jié)合miRs芯片結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析并進(jìn)行大量文獻(xiàn)查閱,按照自噬和侵襲遷移兩大功能進(jìn)行分類,分別篩選出了最有可能調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬的5個(gè)miRs以及10個(gè)侵襲遷移相關(guān)的miRs。(3)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證并明確能夠顯著影響低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬和侵襲遷移的miRs經(jīng)過進(jìn)一步低氧膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U251、T98G、U87和A172)的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,最終確定了低氧下表達(dá)最具顯著差異性的5個(gè)miRs(自噬相關(guān)的miR-155-3p和miR-224-3p,以及侵襲遷移相關(guān)的miR-210、miR-573-5p和miR-584-3p)。通過對低氧培養(yǎng)下5種miRs的敲除和過表達(dá)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞系的進(jìn)一步分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低氧上調(diào)的miR-155-3p和下調(diào)的miR-224均可顯著影響細(xì)胞自噬水平,而侵襲遷移相關(guān)的3個(gè)上調(diào)miRs中僅miR-584-3p能顯著改變U251細(xì)胞系的遷移能力。此外,IL-6同樣可以刺激U251細(xì)胞顯著上調(diào)miR-155-3p。1.4結(jié)論：(1)低氧條件可以顯著改變膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的多種基因和miRs的表達(dá)水平,其中低氧上調(diào)的miR-155-3p和下調(diào)的miR-224能顯著影響U251細(xì)胞自噬水平,而miR-584-3p參與了低氧調(diào)控U251細(xì)胞系的遷移能力的過程。(2)基因芯片是篩選分子調(diào)控靶點(diǎn)的有效工具。1.5創(chuàng)新點(diǎn)：腫瘤低氧微環(huán)境是膠質(zhì)瘤等實(shí)體腫瘤最重要的惡性表型之一,本課題通過使用全基因組表達(dá)譜芯片對體外低氧培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行檢測,在國際上首次發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與膠質(zhì)瘤低氧相關(guān)的microRNAs分子,并闡明了這些低氧相關(guān)的microRNAs的促腫瘤機(jī)制(miR-155-3p、miR-224-3p和miR-584-3p的功能均為國際上的首次報(bào)道)。第二部分低氧誘導(dǎo)的IL-6和miR-155-3p上調(diào)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平的影響和機(jī)制研究及Tocilizumab的輔助療效研究2.1目的：(1)在各級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中檢測HIF-1α、IL-6、LC3B以及IL-6效應(yīng)分子STAT3和p-STAT3的表達(dá)并分析其相關(guān)性。(2)在體外實(shí)驗(yàn)中,利用細(xì)胞系和原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞,研究低氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平和IL-6的分泌的促進(jìn)作用,以及外源性和內(nèi)源性IL-6對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平的促進(jìn)作用及相關(guān)通路；研究miR-155-3p及其下游通路在低氧誘導(dǎo)IL-6促進(jìn)自噬過程中的關(guān)鍵作用；研究低氧下IL-6介導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬改變對凋亡水平的影響。(3)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,研究IL-6和miR-155-3p敲除對低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平變化和腫瘤生長的影響,并評價(jià)IL-6受體單抗Tocilizumab單獨(dú)應(yīng)用和與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)用對低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平變化和腫瘤生長的影響及療效。2.2方法：(1)低氧細(xì)胞培養(yǎng)及刺激、RNA和蛋白水平檢測對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng),同時(shí)利用外源性IL-6、IL-6阻斷抗體、STAT3抑制劑、3-MA、BAF等進(jìn)行相關(guān)刺激,并提取總mRNA和總microRNA用于各相關(guān)分子的實(shí)時(shí)定量PCR檢測,或提取總蛋白用于各相關(guān)分子的western blot檢測。(2)體外實(shí)驗(yàn)中的自噬相關(guān)檢測自噬強(qiáng)度反應(yīng)指標(biāo)：倒置熒光顯微鏡檢測帶熒光標(biāo)記自噬蛋白(GFP-LC3B)的U251和T98G細(xì)胞中LC3B的熒光強(qiáng)度；Western blot法檢測細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3B-I向Ⅱ的轉(zhuǎn)化和P62的降解；透射電鏡法(金標(biāo)準(zhǔn))檢測細(xì)胞內(nèi)自噬小體；3-MA對自噬的抑制和BAF對自噬流的阻斷等。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分別使用GFP-LC3B質(zhì)粒、IL-6小干擾RNA、CREB3小干擾RNA、miR-155-3p inhibitor、miR-155-3p mimics、STAT3結(jié)合區(qū)突變熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-155-3p種子序列結(jié)合區(qū)突變熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒對U251和T98G細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用于自噬監(jiān)測、敲除、過表達(dá)、以及熒光素酶報(bào)告基因檢測。利用IL-6小干擾RNA慢病毒、miR-155-3p inhibitor'慢病毒和miR negative control慢病毒對U251細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)皮下成瘤。(4) ELISA檢測取不同處理組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或動物實(shí)驗(yàn)荷瘤小鼠不同治療組血清進(jìn)行IL-6的ELISA檢測。(5)免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色通過免疫組織化學(xué)染色檢測：101例各級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中HIF-1α、 IL-6.LC3B以及IL-6效應(yīng)分子STAT3和p-STAT3的表達(dá)；5例超薄連續(xù)切片的高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3的共定位現(xiàn)象；各體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的皮下腫瘤中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3、p-STAT3、Ki-67、 Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平。通過免疫熒光染色檢測：5例高級別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本切片中IL-6與各類腫瘤低氧微環(huán)境中的免疫細(xì)胞特異性標(biāo)記的共定位效應(yīng),確定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IL-6的具體來源分布；以及5例人腦高級別膠質(zhì)瘤冰凍切片中C REB3.ATG5和LC3免疫熒光共定位效應(yīng)。(6)細(xì)胞活力和凋亡相關(guān)檢測體外實(shí)驗(yàn)中分別使用CCK-8法、以及PI-AnnexinV流式細(xì)胞染色法、TUNEL免疫熒光染色法、凋亡相關(guān)蛋白caspase3和PARP Western blot法檢測常氧和低氧條件下阻斷IL-6對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞活力和凋亡水平的影響。體內(nèi)試驗(yàn)中使用免疫組化染色法檢測Ki-67和Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平來反映增殖和凋亡。(7)人腦膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)通過皮下成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分別研究IL-6和miR-155-3p敲除、IL-6受體單抗Tocilizumab.以及Tocilizumab與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)用對低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平變化(免疫組織化學(xué)染色)和腫瘤生長(腫瘤體積測量)的影響。2.3結(jié)果：2.3.1人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中HIF-1α、IL-6、p-STAT3、LC3B的表達(dá)與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)101例膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,HIF-1α、IL-6.p-STAT3口LC3B的表達(dá)均隨膠質(zhì)瘤級別升高而上調(diào),STAT3表達(dá)相對穩(wěn)定。HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3口WHO分級之間均存在著較強(qiáng)的兩兩正相關(guān)性；高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明顯的共定位效應(yīng),且圍繞血管周邊低氧區(qū)呈環(huán)形分布；高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本的免疫熒光共定位染色發(fā)現(xiàn)約80%的IL-6來源于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自分泌和旁分泌,各種IL-6分泌型免疫細(xì)胞僅占20%左右。2.3.2低氧顯著上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬水平和IL-6分泌GFP-LC3B熒光結(jié)果和Western blot結(jié)果均顯示U251和T98G細(xì)胞的自噬水平在低氧下顯著上調(diào),且3-MA能抑制該自噬上調(diào),而BAF自噬流阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧下U251和T98G細(xì)胞自噬流通暢。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)U251和T98G細(xì)胞低氧下IL-6的分泌顯著增加。2.3.3外源性和內(nèi)源性IL-6均能通過p-STAT3通路顯著上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平GFP-LC3B免疫熒光、western blot和透射電鏡結(jié)果均發(fā)現(xiàn)常氧條件下外源性IL-6處理的U251和T98G細(xì)胞自噬水平均顯著上調(diào)；使用抗體阻斷或小干擾RNA敲除IL-6能夠顯著抑制IL-6和低氧誘導(dǎo)的自噬；GFP-LC3B免疫熒光和western blot結(jié)果還發(fā)現(xiàn)IL-6通過上調(diào)STAT3的磷酸化水平來激活自噬,阻斷IL-6能夠顯著降低STAT3的磷酸化水平和自噬水平。2.3.4低氧誘導(dǎo)的IL-6/p-STAT3通路通過上調(diào)miR-155-3p的表達(dá)來促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示低氧下miR-155-3p表達(dá)量顯著上調(diào)并具有時(shí)間依賴性,且外源性IL-6也能夠促進(jìn)U251細(xì)胞中miR-155-3p的表達(dá),而IL-6阻斷劑處理的U251細(xì)胞中miR-155-3p的表達(dá)量顯著下調(diào)；p-STAT3抑制劑處理的U251和T98G細(xì)胞中miR-155-3p的表達(dá)量顯著下調(diào)；進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),p-STAT3能夠?qū)iR-155-3p的表達(dá)進(jìn)行直接調(diào)控；GFP-LC3B免疫熒光和western blot結(jié)果均發(fā)現(xiàn),在常氧和低氧條件下使用miR-155-3p inhibitor進(jìn)行miR的敲除能夠顯著下調(diào)U251的自噬水平,且miR-155-3p inhibitor能夠阻斷IL-6對自噬的促進(jìn)作用；而使用miR-155-3p mimics進(jìn)行miR的過表達(dá)能夠顯著上調(diào)U251的自噬水平,且miR-155-3p mimics能夠顯著提高IL-6阻斷抗體和IL-6小干擾RNA處理U251細(xì)胞的自噬水平。2.3.5 miR-155-3p調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬水平的具體分子靶點(diǎn)和機(jī)制以及低氧誘導(dǎo)自噬的完整信號通路miRbase的miR-155-3p直接結(jié)合靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示,CREBRF是miR-155-3p的最佳靶分子,3’UTR區(qū)域中存在三個(gè)結(jié)合力較高的種子序列；熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)CREBRF為miR-155-3p的直接靶點(diǎn)；Western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-155-3p過表達(dá)能顯著下調(diào)CREBRF蛋白水平,并上調(diào)CREBRF下游負(fù)向調(diào)控靶分子CREB3的表達(dá)；敲除U251和T98G細(xì)胞中的CREB3能顯著抑制自噬,且自噬相關(guān)蛋白ATG5為CREB3促進(jìn)自噬現(xiàn)象的效應(yīng)分子；通過對人腦高級別膠質(zhì)瘤冰凍切片進(jìn)行CREB3、ATG5和LC3免疫熒光共定位染色發(fā)現(xiàn),三者具有顯著的共定位關(guān)系。綜上所述,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/ CREB3/ATG5/LC3B/自噬”這一完整信號通路的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證完成(同時(shí)使用原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證)。2.3.6低氧誘導(dǎo)的IL-6通過上調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬水平抑制其凋亡CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)低氧下阻斷IL-6能降低U251的細(xì)胞活力；而通過PI-AnnexinV流式細(xì)胞染色法、TUNEL法和Western blot法檢測均發(fā)現(xiàn)低氧條件下阻斷IL-6能夠顯著提高U251細(xì)胞的凋亡水平。2.3.7體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中敲除IL-6和miR-155-3p能抑制低氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬并抑制腫瘤生長人膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠異位模型結(jié)果顯示IL-6小干擾RNA和miR-155-3p inhibitor均可抑制裸鼠皮下腫瘤的生長；免疫組化法結(jié)果顯示IL-6敲除的皮下腫瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3和Ki-67顯著下降,Cleaved Caspase-3的水平升高,而miR-155-3p敲除的皮下腫瘤中IL-6未受顯著影響,但下游LC3B、p-STAT3和Ki-67顯著下降,Cleaved Caspase-3的水平升高。2.3.8體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中IL-6單抗Tocilizumab通過阻斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬通路抑制腫瘤生長Tocilizumab能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長,并能夠顯著降低荷瘤小鼠血液內(nèi)的IL-6水平(p0.05)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Tocilizumab治療組的皮下腫瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、Ki-67水平顯著下降,Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)。2.3.9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-6單抗Tocilizumab與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)用可提高后者療效Tocilizumab注射液和TMZ均可顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長,Tocilizumab能夠顯著促進(jìn)TMZ的療效(p0.05)；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與前面體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致Tocilizumab能顯著下調(diào)皮下腫瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、和Ki-67水平,并上調(diào)Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平。TMZ治療組IL-6、LC3B、p-STAT3水平顯著上調(diào),而Tocilizumab能夠顯著抑制TMZ對IL-6、LC3B、p-STAT3的上調(diào),并進(jìn)一步上調(diào)Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平。2.4結(jié)論：(1)各級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3和WHO分級之間存在著較強(qiáng)的正相關(guān)性,其中高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IL-6來源以膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身為主,其它多種免疫間質(zhì)細(xì)胞也有部分分泌。首次證實(shí)高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管周環(huán)形低氧區(qū)中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明顯的共定位效應(yīng)。(2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),低氧條件下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬上調(diào)是通過“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬”這一全新完整信號通路實(shí)現(xiàn)的,揭示了IL-6在該過程中重要的始動作用。通過IL-6阻斷抗體抑制IL-6的促自噬作用能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡,提示了IL-6抗體潛在的治療價(jià)值。(3)通過進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-6和miR-155-3p敲除可顯著降低低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬并抑制腫瘤生長,而IL-6單抗Tocilizumab也能夠降低低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬,促進(jìn)凋亡,抑制腫瘤生長,并顯著提高了替莫唑胺(TMZ)的抑瘤療效。這些結(jié)果為抗關(guān)節(jié)炎新藥Tocilizumab在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助治療中的臨床應(yīng)用提供了重要的依據(jù)。2.5創(chuàng)新點(diǎn)：(1)在國際上首次提出并證實(shí)了IL-6是介導(dǎo)低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤自噬的關(guān)鍵啟動因子,并首次報(bào)道了這種IL-6促進(jìn)實(shí)體腫瘤惡性進(jìn)展的新機(jī)制。(2)在國際上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了IL-6促進(jìn)低氧腫瘤細(xì)胞自噬的完整分子通路(低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬),其中p-STAT3對miR-155-3p的直接調(diào)控機(jī)制、miR-155-3p對CREBRF的直接調(diào)控機(jī)制、和CREB3對ATG5調(diào)控機(jī)制均為國際上的首次報(bào)道,均具有非常強(qiáng)的創(chuàng)新性。(3)在國際上首次提出了處于腫瘤血管周圍低氧區(qū)中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過上調(diào)IL-6自分泌和旁分泌提高自身自噬水平,從而抑制凋亡,促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的新假說,并加以闡明。(4)在國際上首次利用IL-6單克隆抗體Tocilizumab進(jìn)行膠質(zhì)瘤輔助治療的動物實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了Tocilizumab注射液在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之外的抗膠質(zhì)瘤作用,并首次證實(shí)了Tocilizumab通過阻斷IL-6誘導(dǎo)的自噬并促進(jìn)凋亡的抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制。(5)更重要的是,由于現(xiàn)有臨床上唯一批準(zhǔn)的抗膠質(zhì)瘤化療藥物替莫唑胺(TMZ)存在極高的耐藥率,而這種耐藥率的產(chǎn)生與替莫唑胺誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞保護(hù)性自噬有密切關(guān)系,我們首次發(fā)現(xiàn)Tocilizumab與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用能顯著抑制這種自噬依賴的耐藥性,大大提高替莫唑胺的抑瘤療效,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和潛在的社會經(jīng)濟(jì)效益。第三部分miR-584-3p對低氧條件下人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移能力的影響及機(jī)制研究3.1目的：(1)檢測各WHO級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-584-3p的表達(dá)水平與其靶分子ROCK1的表達(dá)相關(guān)性,并結(jié)合膠質(zhì)瘤患者的病例隨訪結(jié)局研究miR-584-3p的表達(dá)水平與術(shù)后生存期的關(guān)系。(2)在體外實(shí)驗(yàn)中研究miR-584-3p對低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲遷移能力、細(xì)胞骨架的影響及其直接靶點(diǎn)和分子機(jī)制。(3)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究miR-584-3p對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力的影響。3.2方法：(1)低氧細(xì)胞培養(yǎng)及刺激、RNA和蛋白水平檢測對U251和U87細(xì)胞進(jìn)行低氧處理,結(jié)合各種轉(zhuǎn)染或ROCK1抑制劑Y27632等相關(guān)刺激后,提取總mRNA和總microRNA用于各相關(guān)分子的實(shí)時(shí)定量PCR檢測,或提取總蛋白用于各相關(guān)分子的western blot檢測。(2)侵襲遷移相關(guān)檢測和細(xì)胞骨架熒光染色通過使用常氧和低氧條件下的12h劃痕實(shí)驗(yàn)、24h Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、和24h Matrigel基質(zhì)膠侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測各實(shí)驗(yàn)組U251和U87細(xì)胞遷移侵襲能力的變化。使用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞爬片上的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架免疫熒光染色,觀察細(xì)胞骨架中張力纖維的改變。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分別使用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics、miR-584-5p inhibitor、miR-584-5p mimics、ROCK1、干擾RNA. miR-584-3p種子序列結(jié)合區(qū)突變熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒對U251和U87細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用于敲除、過表達(dá)、以及熒光素酶報(bào)告基因檢測。利用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics'慢病毒和miR negative control慢病毒對U87細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顱內(nèi)原位成瘤。(4)組織標(biāo)本中的免疫組織化學(xué)染色與實(shí)時(shí)定量PCR檢測選取26例各級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,通過免疫組織化學(xué)染色檢測組織標(biāo)本中ROCK1的表達(dá),同時(shí)提取總RNA后使用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測標(biāo)本中miR-584-3p的表達(dá)水平,并將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。(5)生存分析對26例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行隨訪,隨訪結(jié)局為患者是否死亡并記錄死亡時(shí)間。根據(jù)患者手術(shù)標(biāo)本中的miR-584-3p的表達(dá)水平,分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,并進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。(6)顱內(nèi)原位成瘤實(shí)驗(yàn)利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞建立人膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠顱內(nèi)原位模型(立體定向儀接種),隨機(jī)分為miR-584-3p mimics、miR-584-3p inhibitor和negative control三組。通過磁共振定期測量顱內(nèi)腫瘤的大小,觀察miR-584-3p對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的影響。同時(shí)通過HE染色法檢測顱內(nèi)腫瘤邊界和浸潤情況,反應(yīng)膠質(zhì)瘤的侵襲能力變化。并使用免疫組織化學(xué)法檢測miR-584-3p對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中ROCK1的影響。3.3結(jié)果：3.3.1低氧能夠上調(diào)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-584-3p表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明低氧下U251和U87細(xì)胞中的miR-584-3p顯著上調(diào),并在24h左右達(dá)到高峰。3.3.2人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-584-3p的表達(dá)水平隨WHO級別而升高實(shí)時(shí)定量PCR檢測26例不同WHO級別的新鮮人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn),miR-584-3p的表達(dá)水平與級別有關(guān),高級別膠質(zhì)瘤患者(WHO Ⅲ口Ⅳ級)的miR-584-3p的表達(dá)水平顯著高于低級別膠質(zhì)瘤患者(WHO Ⅰ和Ⅱ級)(p0.05)。高級別膠質(zhì)瘤患者(WHO Ⅲ口Ⅳ級)的miR-584-3p的表達(dá)水平(4.4±3.9)組內(nèi)差異較大。3.3.3高表達(dá)miR-584-3p的高級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存期顯著延長高級別膠質(zhì)瘤患者(WHO Ⅲ和Ⅳ級)術(shù)后一年生存率為53.3%,其中miR-584-3p高表達(dá)組的高級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1年生存率為75%,而miR-584-3 p低表達(dá)組的高級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1年生存率僅為28.6%(p=0.03)。3.3.4 miR-584-3p敲除能夠顯著促進(jìn)低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲遷移常氧和低氧條件下的12h劃痕實(shí)驗(yàn)和24h Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-584-3p inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠顯著增強(qiáng)U251和U87細(xì)胞的遷移能力；Matrigel基質(zhì)膠侵襲遷移實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)miR-584-3p inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠顯著增強(qiáng)U251和U87細(xì)胞的侵襲能力。3.3.5miR-584-3p過表達(dá)能顯著抑制低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲遷移常氧和低氧條件下的12h劃痕實(shí)驗(yàn)和24h Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)miR-584-3p mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制U251和U87細(xì)胞的遷移能力；Matrigel基質(zhì)膠侵襲遷移實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)miR-584-3p mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能顯著抑制U251口U87細(xì)胞的侵襲能力。3.3.6 miR-584-3 p通過調(diào)控低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞骨架重構(gòu)抑制侵襲遷移細(xì)胞骨架熒光染色發(fā)現(xiàn),低氧下的U251細(xì)胞形態(tài)明顯伸長,極性增加,細(xì)胞骨架中張力纖維呈明顯的束狀聚集并貫穿與細(xì)胞的長軸,而miR-584-3p敲除能夠顯著增強(qiáng)U251細(xì)胞的極性和張力纖維的束狀聚集；miR-584-3p過表達(dá)能夠消除常氧和低氧下的U251細(xì)胞極性,細(xì)胞呈圓形形態(tài),細(xì)胞骨架中張力纖維束狀聚集現(xiàn)象消失,并高度聚集于細(xì)胞皮層下。3.3.7 miR-584-3p通過直接靶向ROCK1調(diào)控低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力根據(jù)細(xì)胞骨架張力纖維變化,檢測其關(guān)鍵調(diào)控分子ROCK1發(fā)現(xiàn),miR-584-3p能夠顯著改變ROCK1的表達(dá)；而劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)ROCK1抑制劑Y27632和ROCK1小干擾RNA均能夠阻斷miR-584-3p對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力調(diào)控作用；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí),ROCK1為miR-584-3p的直接靶點(diǎn),并通過Western blot進(jìn)行了驗(yàn)證。3.3.8各WHO級別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-584-3p與ROCK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)26例人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的ROCK1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,ROCK1的表達(dá)水平與miR-584-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.7,p0.01。3.3.9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)miR-584-3p能顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移能力并延長生存期人膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠顱內(nèi)原位模型研究發(fā)現(xiàn)miR-584-3p過表達(dá)組顱內(nèi)腫瘤邊界相對清晰和浸潤較少,膠質(zhì)瘤的侵襲能力受到抑制,而miR-584-3p敲除組顱內(nèi)腫瘤邊界不清和浸潤較為明顯,膠質(zhì)瘤的侵襲能力顯著增強(qiáng)；ROCK1免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)miR-584-3p能夠抑制體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中ROCK1的表達(dá)；此外,miR-584-3p過表達(dá)組荷瘤小鼠生存期顯著延長,而敲除組顯著縮短。3.4結(jié)論：(1)雖然高級別膠質(zhì)瘤患者(WHO III和Ⅳ級)的miR-584-3p的表達(dá)水平顯著高于低級別膠質(zhì)瘤患者(WHO Ⅰ和Ⅱ級),但組內(nèi)差異性大。其中,miR-584-3p高表達(dá)的高級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1年生存率較低表達(dá)患者顯著提高,提示miR-584-3p具有抑癌作用,并能夠作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的標(biāo)記。低氧誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-584-3p的表達(dá)升高為反應(yīng)性保護(hù)性上調(diào)。(2)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí),miR-584-3p能夠通過直接靶向抑制ROCK1依賴的細(xì)胞骨架重構(gòu),從而顯著抑制低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力,減少腫瘤浸潤性生長,并限制腫瘤大小,延長生存期。提示miR-584-3p可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抗侵襲治療的潛在干預(yù)靶點(diǎn),具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。3.5創(chuàng)新點(diǎn)：(1)在國際上首次發(fā)現(xiàn)了并報(bào)道了miR-584-3p的生物學(xué)功能,即抑制低氧下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用,并證實(shí)了其直接靶點(diǎn)之一是,ROCK1。(2)在國際上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了人腦膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本中miR-584-3p的表達(dá)水平與預(yù)后生存期的關(guān)系,提供了miR-584-3p是一個(gè)重要的抑癌基因,也是一個(gè)良好的預(yù)后預(yù)測標(biāo)記的直接證據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.4
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本文編號：1573054