本文選題：Parkin　切入點(diǎn)：突變體　出處：《河南大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：Parkin（PARK2）與常染色體隱性遺傳的家族性帕金森病相關(guān)，Parkin蛋白分子量為52kD，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，是一種E3泛素連接酶，可以保護(hù)對(duì)細(xì)胞毒性的各種應(yīng)激，并且在帕金森病的保護(hù)中起重要作用。β-synP123H突變體能夠在細(xì)胞中形成溶酶體樣包涵體，從而導(dǎo)致自噬性細(xì)胞退化。 國(guó)內(nèi)外對(duì)Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬有諸多報(bào)道，但是對(duì)于Parkin在β-synP123H誘導(dǎo)的突觸核蛋白病理變化過(guò)程中對(duì)蛋白的降解、細(xì)胞的自噬和存活所起到的作用和機(jī)制并不清楚。 這項(xiàng)研究中，我們探討Parkin及其突變體在β-synP123H誘導(dǎo)的突觸核蛋白病理變化過(guò)程中的作用，有助于澄清帕金森病突觸核蛋白病理變化過(guò)程的發(fā)病機(jī)制，為帕金森病的治療和預(yù)防提供新的理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)PCR構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的Parkin野生型（ParkinWT）和兩步PCR構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的Parkin突變體R42P、T240R、R275W、C441R的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切和測(cè)序確定序列的正確性，通過(guò)Western Blot的方法確定質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞上表達(dá)；通過(guò)細(xì)胞爬片和免疫熒光技術(shù)了解野生型和突變型Parkin在細(xì)胞內(nèi)的分布特征；通過(guò)WST-1和LDH的測(cè)定來(lái)了解和分析野生型和突變型的Parkin本身對(duì)于細(xì)胞的存活的影響以及對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。發(fā)現(xiàn)野生型Parkin彌散分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)，而突變型Parkin在細(xì)胞的胞漿內(nèi)細(xì)胞核周?chē)市☆w粒狀的包涵體存在，Parkin突變體具有細(xì)胞毒性。 其次，構(gòu)建并篩選出穩(wěn)定表達(dá)Parkin野生型和突變型R42P、T240R、R275W、C441R的Hela細(xì)胞株，在穩(wěn)定表達(dá)Parkin的細(xì)胞株上，運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記的方法，研究Parkin及其突變體對(duì)線(xiàn)粒體的影響。我們發(fā)現(xiàn)突變型Parkin導(dǎo)致線(xiàn)粒體的聚集和片段化，F(xiàn)CCP處理細(xì)胞導(dǎo)致線(xiàn)粒體去極化，ParkinWT能夠被募集到去極化的線(xiàn)粒體上，但是Parkin突變體喪失了這一功能。 最后，，在穩(wěn)定表達(dá)Parkin野生型和突變型T240R的Hela細(xì)胞株上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCEP4，β-syn野生型（β-synWT）和β-synP123H，分別通過(guò)Parkin和β-syn，Parkin和LC3以及β-syn和p62的免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，LC3和β-syn的Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究ParkinWT和ParkinT240R對(duì)自噬和β-synP123H的作用，發(fā)現(xiàn)ParkinWT能夠促進(jìn)β-synP123H通過(guò)自噬溶酶體途徑降解，減緩β-synP123H在細(xì)胞內(nèi)的累積，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，Parkin突變體的作用與ParkinWT的作用相反。在穩(wěn)定表達(dá)β-synP123H的293T細(xì)胞上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTRE2hyg、Parkin野生型和四種突變體后，檢測(cè)Atg5、Beclin-1的水平和mTOR通路上的mTOR、p70S6K、4E-BP1的磷酸化水平也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。 結(jié)論：野生型和突變型Parkin在細(xì)胞內(nèi)的分布特征不同，Parkin突變體具有細(xì)胞毒性，能夠使線(xiàn)粒體片段化和聚集，而且不能被募集到去極化的線(xiàn)粒體上，誘導(dǎo)細(xì)胞退化；野生型Parkin通過(guò)調(diào)控mTOR通路調(diào)節(jié)自噬，促使β-synP123H進(jìn)入自噬小體和溶酶體內(nèi)降解，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，Parkin突變體抑制β-synP123H蛋白降解，促進(jìn)β-synP123H蛋白的累積，增強(qiáng)路易體癡呆相關(guān)的神經(jīng)退化。
[Abstract]:Parkin (PARK2) associated with autosomal recessive familial Parkinson disease, Parkin protein molecular weight of 52kD, mainly distributed in the cytoplasm, an E3 ubiquitin ligase that can protect all the stress on the cell toxicity, and play an important role in the protection of Parkinson's disease. Beta -synP123H mutant can form a lysosome like inclusion in body cells, leading to autophagic cell degeneration.
There are many reports about Parkin mediated mitochondrial autophagy at home and abroad, but it is not clear about the role and mechanism of Parkin in protein degradation, cell autophagy and survival in the pathological change of beta -synP123H induced synuclein.
In this study, we investigate the synuclein pathological changes in Parkin and its mutant beta induced -synP123H, help to clarify the pathogenesis of Parkinson's disease synuclein pathology process, for the treatment and prevention of Parkinson's disease and provide new theoretical basis.
This experiment firstly constructed by PCR with HA tag Parkin wild type (ParkinWT) and the two step construction of PCR Parkin mutant R42P, HA tagged T240R, R275W, eukaryotic expression plasmid C441R, to determine the correct sequence by double enzyme digestion and sequencing, the Western Blot method to determine the plasmid expression in it nuclear cells; the cell slide and immunofluorescence technique of wild type and mutant Parkin distribution in cells was determined by WST-1 and LDH; to understand and analyze the wild type and mutant Parkin itself for cell survival and toxicity on the cells. It was found that the wild type Parkin dispersed in in the cytoplasm and around the mutant Parkin in the cytoplasm of cells within the nucleus is small granular inclusion bodies, Parkin mutants with cell toxicity.
Secondly, constructed and screened stable expression of wild type Parkin and mutant R42P, T240R, R275W, Hela, C441R cells, the stable expression of Parkin cell line, by using the method of immunofluorescence double labeling, effects of Parkin and its mutants of mitochondria. We found that the mutant Parkin leads to aggregation and fragmentation of mitochondria FCCP treatment, cells leading to mitochondrial depolarization, ParkinWT can be recruited to the depolarization of mitochondria, but Parkin mutant lost this function.
Finally, the stable expression of Parkin wild-type and mutant T240R in Hela cell line, transient transfection of pCEP4 and wild-type -syn beta (beta -synWT) and 3 -synP123H, respectively by Parkin and Parkin and beta -syn, LC3 and beta -syn and p62 immunofluorescence double labeling experiment, Western Blot experiment LC3 and beta -syn and the effects of ParkinWT and ParkinT240R on autophagy and beta -synP123H, ParkinWT beta can promote the degradation of -synP123H through the lysosomal pathway, the accumulation of slow beta -synP123H in cells and plays an important role in protecting cells, and the opposite effect. The effect of ParkinWT Parkin mutant in stable -synP123H expression on 293T cells transiently transfected into pTRE2hyg. Parkin wild type and four mutants, Atg5 detection, and mTOR pathway of Beclin-1 on mTOR, p70S6K, 4E-BP1 phosphorylation also proved this point.
Conclusion: the distribution of wild type and mutant Parkin in the cells of different Parkin mutants with cell toxicity, can cause mitochondrial fragmentation and aggregation, and can not be raised to the depolarization of mitochondria, induce cell degeneration; wild type Parkin regulates mTOR pathway regulates autophagy, promote beta -synP123H into autophagosomes and solution enzyme degradation in vivo, plays an important role in protecting cells, inhibition of Parkin mutant beta -synP123H protein degradation, promote the accumulation of beta -synP123H protein, enhance the neural correlates of dementia Louis degradation.

【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1569393