本文關(guān)鍵詞： 自身免疫性神經(jīng)炎 微小RNA-338 外周神經(jīng) 超微結(jié)構(gòu) 蛋白表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、實驗性自身免疫性神經(jīng)炎大鼠模型(一)研究目的：深入研究格林巴利綜合征動物模型,分別從模型大鼠的臨床表現(xiàn)、體重、神經(jīng)肌肉功能、外周神經(jīng)組織形態(tài)學(xué),包括超微結(jié)構(gòu)、光鏡形態(tài)、免疫熒光化學(xué),以及外周神經(jīng)電生理和腓腸肌光鏡形態(tài)等幾個方面綜合評價格林巴利綜合征大鼠模型的疾病進(jìn)展情況；并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了炎性因子Iba1在大鼠模型坐骨神經(jīng)中的表達(dá)及定位情況,那就力圖建立更全面的大鼠格林巴利綜合征模型疾病進(jìn)展評價指標(biāo),為利用該模型進(jìn)行格林巴利綜合征治療方法及相關(guān)機(jī)制的研究提供新的研發(fā)思路和評價指標(biāo)。(二)研究方法：本研究模型動物選取Lewis雌性大鼠20只,將其隨機(jī)分為實驗組10只與對照組10只。實驗組采用P0180-199多肽、不完全弗氏佐劑(IFA)和結(jié)核菌素(H37Ra)混合制劑通過大鼠雙足墊進(jìn)行免疫,對照組將0.9%生理鹽水等量相同方法足墊注射。免疫后連續(xù)觀察癥狀、體重,進(jìn)行臨床神經(jīng)肌肉功能評分,兩組于疾病高峰期即免疫后第18天(據(jù)臨床評分曲線得出)在體檢測坐骨神經(jīng)電生理、取材進(jìn)行電鏡及免疫熒光化學(xué)、光鏡下腓腸肌HE染色及運動終板乙酰膽堿酯酶的檢測,其中重點研究坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)及免疫熒光化學(xué)指標(biāo),免疫熒光化學(xué)指標(biāo)選取CD3(T細(xì)胞),Iba-1(巨噬細(xì)胞),S100(髓鞘),neurofilament 200 (軸突)。(三)研究結(jié)果：1.模型大鼠誘導(dǎo)后第1天開始出現(xiàn)癥狀,第7天時所有大鼠均出現(xiàn)尾巴下垂,提示造模成功,17-18天達(dá)疾病高峰,約42天疾病恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)；2.EAN組大鼠發(fā)病過程中第7,14,21,28,35,42天,體重(單位：g)分別為：160±2.07,173.3±16.8,190.5±14.6,198.6±6.7,207.3±6.9,216.8±8.9,較對照組體重(169.2±0.57,178.5±9.6,202±±10.6,210.5±13.7,216±5.6,223.9±4.6)明顯降低,并有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；3.疾病高峰期,EAN組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(19.69+4.47)m/s,明顯低于對照組(30.98±2.71)m/s(P0.0001)；EAN組坐骨神經(jīng)復(fù)合動作電位振幅(峰-峰值)(2.12±0.83)mV,明顯低于對照組(12.18±1.71)mV(P0.0001)；4.疾病高峰期,EAN組坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為3種病理改變：水腫、空洞形成、髓鞘脫失,伴隨軸突變細(xì)或消失；腓腸肌纖維變細(xì)、胞漿淡染,運動終板乙酰膽堿酯酶數(shù)量減少、顏色變淺；5.坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以水腫、脫失為主者免疫組織化學(xué)指標(biāo)Iba-1 (microglia)、CD3(Tcells)增多明顯,坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以空洞形成、脫失為主者神經(jīng)髓鞘蛋白S100明顯減少,坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以脫失為主者神經(jīng)軸蛋白neurofilament200減少。實驗過程中發(fā)現(xiàn)Iba-I與S100在髓鞘上共染,提示血旺細(xì)胞在疾病的進(jìn)程中可能起到類似巨噬細(xì)胞的作用。(四)研究意義：本實驗EAN發(fā)病過程及高峰期的各項評價指標(biāo)為該模型進(jìn)-步的病生理過程探討提供了依據(jù)。發(fā)現(xiàn)Iba-I與S100在髓鞘上共染,提示血旺細(xì)胞在疾病的進(jìn)程中可能起到類似巨噬細(xì)胞的作用,這對該模型是一個有用的補充,為GBS的治療提供了新的視角。同時模型的成功建立和研究,為本課題微小RNA的治療奠定了動物模型的基礎(chǔ)。二、攜帶微小RNA-338 (miR-338-LV)的慢病毒對自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)大鼠模型的干預(yù)研究(一)研究目的：miR-338-LV對促進(jìn)EAN模型大鼠坐骨神經(jīng)運動功能恢復(fù)的研究。(二)研究方法：1.構(gòu)建慢病毒攜帶的促進(jìn)雪旺細(xì)胞髓鞘化的miRNA-338,即miR-338-LV病毒液；2.實驗分組：Lewis雌性大鼠60只隨機(jī)分為治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)、模型組、正常對照組各15只。前三組用P0180-199、H37Ra、生理鹽水、IFA混合液200ul二等分等量注射入雌性Lewis大鼠雙足墊制備EAN動物模型(見第二章),正常對照組足墊注射相同劑量的生理鹽水。3.藥物干預(yù)：治療組于免疫后出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(即尾巴下垂,評分1分)時于坐骨神經(jīng)局部多點注射miR-338-LV,1次,每個部位約25ul,6個部位,總量150ul；陽性藥物組于免疫后出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(即尾巴下垂,評分1分)時通過大鼠尾靜脈按照100mg/100g體重注射丙種球蛋白(IVIg),1次/天,連續(xù)2天。4.指標(biāo)觀察：治療組、陽性藥物組、模型組及正常對照組分別在免疫后疾病高峰期及免疫后42天采用生物機(jī)能實驗系統(tǒng)檢測大鼠坐骨神經(jīng)運動傳導(dǎo)速度及復(fù)合肌肉動作電位振幅,取材進(jìn)行坐骨神經(jīng)電鏡、腓腸肌光鏡、坐骨神經(jīng)S100、Iba-1(microglia)、neurofilament200等蛋白的免疫熒光化學(xué)指標(biāo)等的變化,實驗中連續(xù)觀察大鼠行為學(xué)變化和體重,并評分。(三)研究結(jié)果：1.治療組(miR-338組)及陽性藥物組(IVIg組)疾病高峰出現(xiàn)時間分別為第21天和第22天,較模型組第18天延遲；治療組(miR-338組)及陽性藥物組(IVIg組)在疾病高峰期的臨床神經(jīng)肌肉評分分值分別為(3.5±0.4)分和(2.75±0.25)分,較模型組(3.92±0.2)顯著降低(P0.05),治療組(miR-338組)及陽性藥物組(IVIg組)之間有顯著性差異(P0.05)；治療組(miR-338組)及陽性藥物組(IVIg組)在疾病恢復(fù)期的臨床神經(jīng)肌肉評分分值較模型組(2.0±0.32)顯著降低(P0.05),治療組(miR-338組)及陽性藥物組(IVIg組)的臨床神經(jīng)肌肉評分分值分別為1.2±0.12,1.0±0.24,二者之間無顯著性差異(P0.05)。治療組從治療到恢復(fù)時間30天,較陽性藥物組36天明顯縮短。2.治療組(miR-338組)較陽性藥物組(IVIg組)在疾病高峰期的神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著提高,治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)的傳導(dǎo)速度分別為(28.41±0.7)m/s和(25.4±20.98)m/s,二者之間有顯著性差異(P0.01)。治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)及模型組在疾病高峰期和恢復(fù)期的神經(jīng)傳導(dǎo)速度均較正常對照組低。治療組(miR-338組)和陽性藥物組(IVIg組)疾病高峰期的傳導(dǎo)速度較模型組(19.69±4.47m/s)顯著提高。治療組(miR-338組)與陽性藥物組(IVIg組)在疾病恢復(fù)期的神經(jīng)傳導(dǎo)速度相同,無顯著性差異。3.治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)在疾病高峰期的復(fù)合動作電位波幅較模型組(2.12±0.83mV)顯著提高,治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)的復(fù)合動作電位波幅分別為(6.47+0.12)mV和(6.03±0.1)mV,二者之間無顯著性差異。治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)及模型組(EAN組)在疾病高峰期和恢復(fù)期的復(fù)合動作電位波幅均較正常對照組低。治療組(miR-338組)與陽性藥物組(IVIg組)在疾病恢復(fù)期的復(fù)合動作電位波幅相同,無顯著性差異。4.光鏡腓腸肌檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)疾病高峰期,治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)及模型組(EAN組)大鼠腓腸肌均表現(xiàn)為不同程度的細(xì)胞膜完整性破壞,細(xì)胞質(zhì)染色不均勻、顏色變淺,細(xì)胞核偏離邊緣,或消失,肌纖維雜亂、變細(xì),之間空隙增大。治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)的病變程度輕于模型組。疾病恢復(fù)期,各組大鼠腓腸肌結(jié)構(gòu)明顯改善,細(xì)胞膜完整性增強(qiáng),細(xì)胞質(zhì)染色均勻,細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣,肌纖維間空隙變小。5.透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)發(fā)現(xiàn),治療組(miR-338組)、陽性藥物組(IVIg組)及模型組(EAN組)坐骨神經(jīng)均有三種病理表現(xiàn),髓鞘剝脫、髓鞘空洞形成及髓鞘腫脹。高峰期,干預(yù)組均比模型對照組顯示出較輕的病變,剝脫及空洞處可見組織增生及細(xì)胞修復(fù)的組織結(jié)構(gòu),腫脹程度較輕。治療組(miR-338組)髓鞘數(shù)目明顯增多,髓鞘腫脹數(shù)目在陽性藥物組(IVIg組)中明顯減少�；謴�(fù)期,治療組(miR-338組)與陽性藥物組(IVIg組)相同,無顯著性差異。6.免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療組(miR-338組)較陽性藥物組(IVIg組)高峰期S100表達(dá)顯著增高；與EAN組相比,治療組(miR-338組)和陽性藥物組(IVIg組)治療后高峰期Iba1表達(dá)顯著減少,S100、NF200表達(dá)顯著增多�；謴�(fù)期,治療組與陽性藥物組無明顯差異。(四)研究意義：以慢病毒為載體的miRNA-338局部注射入坐骨神經(jīng)后的過表達(dá)作用能改善EAN發(fā)病過程中神經(jīng)肌肉功能,延長高峰期出現(xiàn)時間,縮短病程,提高疾病高峰期坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、動作電位振幅,減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)髓鞘及軸突再生。特別在縮短病程,提高疾病高峰期坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度,促進(jìn)神經(jīng)髓鞘再生這幾個方面較陽性藥物組作用更為顯著。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R744.5;R-332

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本文編號：1529171