本文關(guān)鍵詞： GDF11 腦缺血 神經(jīng)再生 Smad2/3 凋亡　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景腦中風(fēng)是臨床最常見的疾病之一,具有發(fā)病率、致殘率和病死率高的特點(diǎn),其中缺血性腦中風(fēng)占全部腦中風(fēng)的70%～80%。治療缺血性腦中風(fēng)常用的藥物有三大類,分別是通過促使血管再通復(fù)流的溶栓治療藥物、通過減少細(xì)胞損傷,改善腦血流的神經(jīng)保護(hù)劑,以及中草藥藥物治療。但是由于許多藥物存在著療效弱、副作用多等問題,尋找高效安全的治療藥物仍然任重道遠(yuǎn)。近年來人們采用小鼠聯(lián)體共生模型進(jìn)行抗衰老和再生的研究,發(fā)現(xiàn)在年輕鼠血液中含有可以"返老還童"的生長(zhǎng)分化因子11(Growth differentiation factor 11,GDF11):它可以改善因衰老而導(dǎo)致的機(jī)能下降例如肌肉萎縮、心力衰竭、反應(yīng)遲鈍、認(rèn)知能力降低等,為衰老和再生醫(yī)學(xué)的研究帶來了新的曙光。GDF11是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)家族的成員。研究結(jié)果顯示血液中GDF11分子的表達(dá)隨著年紀(jì)的增加而降低,向老年小鼠體內(nèi)連續(xù)注入體外重組的GDF11蛋白,使其含量恢復(fù)到年輕小鼠體內(nèi)相同的水平時(shí),可以導(dǎo)致許多因衰老而出現(xiàn)的機(jī)能下降有所緩和甚至恢復(fù)到原先的水平,與年輕血液的作用基本一致。這些結(jié)果說明GDF11對(duì)體內(nèi)多種組織器官因衰老引起的功能下降具有明顯的改善作用。然而目前對(duì)于GDF11在衰老和再生的作用還存在著爭(zhēng)議,因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)將體外重組的GDF11蛋白注入老年小鼠體內(nèi)抑制了肌肉的再生,得到了相反的結(jié)果。研究報(bào)道GDF11可以增強(qiáng)老年小鼠腦內(nèi)的血液循環(huán),促進(jìn)室管膜下區(qū)(Subventricularzone,SVZ)神經(jīng)干細(xì)胞增殖進(jìn)而使神經(jīng)元存活能力增強(qiáng),說明GDF11對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)再生具有促進(jìn)的作用。另外有文獻(xiàn)證實(shí),GDF11在腦缺血再灌注大鼠的皮層缺血半影區(qū)表達(dá)量顯著升高,猜測(cè)GDF11可能參與腦缺血再灌注引起的腦損傷的修復(fù)過程。在缺血性腦中風(fēng)后GDF11對(duì)腦缺血引起的損傷到底發(fā)揮什么作用?是正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控?為了解決這些問題,本課題中我們用線栓法局灶性腦缺血再灌注大鼠模型為研究對(duì)象,運(yùn)用分子細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試等方法來研究GDF11對(duì)腦缺血損傷的防治作用及機(jī)制。研究目的1、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用及機(jī)制。2、GDF11在腦缺血損傷預(yù)防中的作用及機(jī)制。研究方法1、建立線栓法局灶性腦缺血再灌注模型使用栓線堵塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈造成大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),2小時(shí)缺血之后拔線進(jìn)行血液再灌注。2、腦立體定位微量注射將大鼠用水合氯醛麻醉之后固定在腦立體定位儀上,充分暴露顱骨,以前囟點(diǎn)為零點(diǎn),按照腦室坐標(biāo)進(jìn)行打孔注射,腦室坐標(biāo):前后(AP),-0.9mm;左右(L),±1.5mm;背腹(V),-3.6mm。3、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)注射和免疫組織化學(xué)染色大鼠在灌流取腦前2小時(shí)進(jìn)行腹腔注射BrdU,取腦后將腦從前向后切成40微米的薄片進(jìn)行免疫組化染色。BrdU的一抗使用濃度1:500,GDF11的一抗?jié)舛?1:1000,Caspase-3 的一抗?jié)舛?1:500,Ki67 一抗?jié)舛?1:100,Nestin 一抗?jié)舛?:500。4、實(shí)時(shí)定量PCR將腦組織取出,提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用SYBR Green熒光標(biāo)記法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測(cè)GDF11和內(nèi)參β-actin的mRNA表達(dá)水平。5、評(píng)估腦缺血體積取腦后將腦從前向后切成2毫米的腦片,將切好的腦片放在37℃氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液里,避光孵育30分鐘后,可觀察腦缺血范圍大小,最后使用Photoshop軟件計(jì)算腦缺血面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、腦缺血后大鼠皮層缺血半影區(qū)GDF11的表達(dá)水平顯著上升取成功建立腦缺血再灌注模型的大鼠和假手術(shù)大鼠各3只,24h后灌流取腦,用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)GDF11的表達(dá),發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)皮層半影區(qū)GDF11的表達(dá)要顯著高于假手術(shù)組。另取成功造模的大鼠分別再灌注2h、6h、12h、24h、48h后,取其皮層半影區(qū),提取RNA做實(shí)時(shí)熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)6h后GDF11 mRNA水平顯著上升,48h后恢復(fù)到正常水平。2、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用2.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠腦缺血體積下降建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后活體取腦進(jìn)行TTC染色,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比腦缺血體積顯著降低。2.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠神經(jīng)功能改善建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比神經(jīng)功能缺陷評(píng)分顯著下降。3、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用機(jī)制3.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細(xì)胞凋亡建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL試劑盒染色,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中皮層半影區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著降低。3.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白使室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖水平下降對(duì)大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦,通過增殖標(biāo)記物BrdU、Ki67進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導(dǎo)致室管膜下區(qū)BrdU陽性細(xì)胞及Ki67陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低。3.3缺血后給予GDF11外源重組蛋白對(duì)室管膜下區(qū)周圍血管重構(gòu)無影響為了觀察GDF11外源蛋白對(duì)室管膜下區(qū)周圍血管再生的影響,建立大鼠腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦,通過血管再生標(biāo)記物CD31進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導(dǎo)致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著變化。4、GDF11在腦缺血損傷預(yù)防中的作用4.1過表達(dá)GDF11預(yù)處理可減少大鼠腦缺血體積對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11過表達(dá)病毒及陰性對(duì)照病毒,病毒表達(dá)12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,活體取腦進(jìn)行TTC染色,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中腦缺血體積顯著降低。4.2過表達(dá)GDF11預(yù)處理可降低大鼠神經(jīng)功能缺陷對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11過表達(dá)病毒及陰性對(duì)照病毒,病毒表達(dá)12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)功能缺陷評(píng)分顯著下降。5、過表達(dá)GDF11對(duì)腦缺血損傷預(yù)防的作用機(jī)制5.1過表達(dá)GDF11預(yù)處理顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細(xì)胞凋亡對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11過表達(dá)病毒及陰性對(duì)照病毒,病毒表達(dá)12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取腦進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL試劑盒染色,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,皮層缺血半影區(qū)的凋亡細(xì)胞受到了保護(hù)。5.2過表達(dá)GDF11預(yù)處理可促使腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)細(xì)胞增殖向大鼠側(cè)腦室微量注射GDF11過表達(dá)慢病毒,病毒表達(dá)12天之后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2小時(shí)再灌注3天后對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射BrdU,2小時(shí)后進(jìn)行灌流取腦和免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF11使得MCAO大鼠SVZ腦區(qū)增殖標(biāo)記物BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著上升。5.3過表達(dá)GDF11預(yù)處理促進(jìn)腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)周圍血管再生對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射GDF11過表達(dá)病毒及陰性對(duì)照病毒,病毒表達(dá)12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取腦通過血管再生標(biāo)記物CD31進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11過表達(dá)后導(dǎo)致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。6、GDF11通過調(diào)控Smad2/3信號(hào)通路參與腦缺血損傷的治療及預(yù)防作用為了闡明GDF11參與腦缺血防治的分子機(jī)制,我們?nèi)》謩e注射了 GDF11外源重組蛋白及注射了 PBS的大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注模型的建立,缺血2h再灌注3天后對(duì)大鼠缺血半影區(qū)進(jìn)行取材,通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GDF11外源蛋白的處理使得pSmad2/3 水平顯著升高。同樣,我們對(duì)大鼠注射GDF11過表達(dá)病毒及陰性對(duì)照病毒12天后建立腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后對(duì)大鼠缺血半影區(qū)進(jìn)行取材,通過Western blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GDF11預(yù)處理使得pSmad2/3水平顯著升高�？傊�,GDF11通過調(diào)控Smad2/3信號(hào)通路參與腦缺血的預(yù)防和治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1、腦缺血再灌注后,GDF11在皮層缺血半影區(qū)表達(dá)上調(diào)。2、GDF11可以參與治療腦缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷,通過抑制半影區(qū)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。3、GDF11在腦缺血再灌注預(yù)防中發(fā)揮作用,可通過促進(jìn)SVZ腦區(qū)細(xì)胞增殖,增強(qiáng)周圍血管的再生以及抑制半影區(qū)細(xì)胞凋亡方式,減少腦缺血再灌注造成的損傷。4、GDF11在腦缺血防治中的作用是通過調(diào)控Smad2/3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。創(chuàng)新點(diǎn)1、GDF11對(duì)大鼠腦缺血再灌注所致的損傷具有預(yù)防和治療作用。2、GDF11在預(yù)防和治療大鼠腦缺血再灌注損傷方面的作用機(jī)制不同。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

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