本文關鍵詞： GDF11 腦缺血 神經(jīng)再生 Smad2/3 凋亡　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景腦中風是臨床最常見的疾病之一,具有發(fā)病率、致殘率和病死率高的特點,其中缺血性腦中風占全部腦中風的70%～80%。治療缺血性腦中風常用的藥物有三大類,分別是通過促使血管再通復流的溶栓治療藥物、通過減少細胞損傷,改善腦血流的神經(jīng)保護劑,以及中草藥藥物治療。但是由于許多藥物存在著療效弱、副作用多等問題,尋找高效安全的治療藥物仍然任重道遠。近年來人們采用小鼠聯(lián)體共生模型進行抗衰老和再生的研究,發(fā)現(xiàn)在年輕鼠血液中含有可以"返老還童"的生長分化因子11(Growth differentiation factor 11,GDF11):它可以改善因衰老而導致的機能下降例如肌肉萎縮、心力衰竭、反應遲鈍、認知能力降低等,為衰老和再生醫(yī)學的研究帶來了新的曙光。GDF11是轉化生長因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)家族的成員。研究結果顯示血液中GDF11分子的表達隨著年紀的增加而降低,向老年小鼠體內(nèi)連續(xù)注入體外重組的GDF11蛋白,使其含量恢復到年輕小鼠體內(nèi)相同的水平時,可以導致許多因衰老而出現(xiàn)的機能下降有所緩和甚至恢復到原先的水平,與年輕血液的作用基本一致。這些結果說明GDF11對體內(nèi)多種組織器官因衰老引起的功能下降具有明顯的改善作用。然而目前對于GDF11在衰老和再生的作用還存在著爭議,因為有研究發(fā)現(xiàn)將體外重組的GDF11蛋白注入老年小鼠體內(nèi)抑制了肌肉的再生,得到了相反的結果。研究報道GDF11可以增強老年小鼠腦內(nèi)的血液循環(huán),促進室管膜下區(qū)(Subventricularzone,SVZ)神經(jīng)干細胞增殖進而使神經(jīng)元存活能力增強,說明GDF11對腦內(nèi)神經(jīng)再生具有促進的作用。另外有文獻證實,GDF11在腦缺血再灌注大鼠的皮層缺血半影區(qū)表達量顯著升高,猜測GDF11可能參與腦缺血再灌注引起的腦損傷的修復過程。在缺血性腦中風后GDF11對腦缺血引起的損傷到底發(fā)揮什么作用?是正調控還是負調控?為了解決這些問題,本課題中我們用線栓法局灶性腦缺血再灌注大鼠模型為研究對象,運用分子細胞生物學和動物行為學測試等方法來研究GDF11對腦缺血損傷的防治作用及機制。研究目的1、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用及機制。2、GDF11在腦缺血損傷預防中的作用及機制。研究方法1、建立線栓法局灶性腦缺血再灌注模型使用栓線堵塞大鼠右側大腦中動脈造成大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),2小時缺血之后拔線進行血液再灌注。2、腦立體定位微量注射將大鼠用水合氯醛麻醉之后固定在腦立體定位儀上,充分暴露顱骨,以前囟點為零點,按照腦室坐標進行打孔注射,腦室坐標:前后(AP),-0.9mm;左右(L),±1.5mm;背腹(V),-3.6mm。3、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)注射和免疫組織化學染色大鼠在灌流取腦前2小時進行腹腔注射BrdU,取腦后將腦從前向后切成40微米的薄片進行免疫組化染色。BrdU的一抗使用濃度1:500,GDF11的一抗?jié)舛?1:1000,Caspase-3 的一抗?jié)舛?1:500,Ki67 一抗?jié)舛?1:100,Nestin 一抗?jié)舛?:500。4、實時定量PCR將腦組織取出,提取總RNA后反轉錄成cDNA,用SYBR Green熒光標記法實時定量PCR技術,檢測GDF11和內(nèi)參β-actin的mRNA表達水平。5、評估腦缺血體積取腦后將腦從前向后切成2毫米的腦片,將切好的腦片放在37℃氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液里,避光孵育30分鐘后,可觀察腦缺血范圍大小,最后使用Photoshop軟件計算腦缺血面積。實驗結果1、腦缺血后大鼠皮層缺血半影區(qū)GDF11的表達水平顯著上升取成功建立腦缺血再灌注模型的大鼠和假手術大鼠各3只,24h后灌流取腦,用免疫組織化學的方法檢測GDF11的表達,發(fā)現(xiàn)缺血側皮層半影區(qū)GDF11的表達要顯著高于假手術組。另取成功造模的大鼠分別再灌注2h、6h、12h、24h、48h后,取其皮層半影區(qū),提取RNA做實時熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)6h后GDF11 mRNA水平顯著上升,48h后恢復到正常水平。2、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用2.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠腦缺血體積下降建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進行側腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后活體取腦進行TTC染色,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比腦缺血體積顯著降低。2.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白促使大鼠神經(jīng)功能改善建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進行側腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進行評分,結果發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比神經(jīng)功能缺陷評分顯著下降。3、GDF11在腦缺血損傷治療中的作用機制3.1缺血后給予GDF11外源重組蛋白顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細胞凋亡建立腦缺血再灌注大鼠模型,缺血2h再灌注24h后,進行側腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦進行免疫組織化學染色和TUNEL試劑盒染色,發(fā)現(xiàn)實驗組中皮層半影區(qū)凋亡細胞的數(shù)量顯著降低。3.2缺血后給予GDF11外源重組蛋白使室管膜下區(qū)細胞增殖水平下降對大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,進行側腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦,通過增殖標記物BrdU、Ki67進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導致室管膜下區(qū)BrdU陽性細胞及Ki67陽性細胞數(shù)顯著降低。3.3缺血后給予GDF11外源重組蛋白對室管膜下區(qū)周圍血管重構無影響為了觀察GDF11外源蛋白對室管膜下區(qū)周圍血管再生的影響,建立大鼠腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,進行側腦室注射GDF11外源重組蛋白,3天后灌流取腦,通過血管再生標記物CD31進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11水平升高后導致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細胞數(shù)目無顯著變化。4、GDF11在腦缺血損傷預防中的作用4.1過表達GDF11預處理可減少大鼠腦缺血體積對大鼠進行側腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒,病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,活體取腦進行TTC染色,發(fā)現(xiàn)實驗組中腦缺血體積顯著降低。4.2過表達GDF11預處理可降低大鼠神經(jīng)功能缺陷對大鼠進行側腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒,病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,根據(jù)Longa及Bederson的5分制法進行評分,結果發(fā)現(xiàn)實驗組中神經(jīng)功能缺陷評分顯著下降。5、過表達GDF11對腦缺血損傷預防的作用機制5.1過表達GDF11預處理顯著降低皮層缺血半影區(qū)的細胞凋亡對大鼠進行側腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒,病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取腦進行免疫組織化學染色和TUNEL試劑盒染色,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比,皮層缺血半影區(qū)的凋亡細胞受到了保護。5.2過表達GDF11預處理可促使腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)細胞增殖向大鼠側腦室微量注射GDF11過表達慢病毒,病毒表達12天之后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2小時再灌注3天后對大鼠進行腹腔注射BrdU,2小時后進行灌流取腦和免疫組織化學染色,結果發(fā)現(xiàn)GDF11使得MCAO大鼠SVZ腦區(qū)增殖標記物BrdU陽性細胞數(shù)顯著上升。5.3過表達GDF11預處理促進腦缺血再灌注模型大鼠SVZ腦區(qū)周圍血管再生對大鼠進行側腦室注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒,病毒表達12天后建立局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后,灌流取腦通過血管再生標記物CD31進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)GDF11過表達后導致室管膜下區(qū)周圍CD31陽性細胞數(shù)顯著增加。6、GDF11通過調控Smad2/3信號通路參與腦缺血損傷的治療及預防作用為了闡明GDF11參與腦缺血防治的分子機制,我們?nèi)》謩e注射了 GDF11外源重組蛋白及注射了 PBS的大鼠進行腦缺血再灌注模型的建立,缺血2h再灌注3天后對大鼠缺血半影區(qū)進行取材,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)GDF11外源蛋白的處理使得pSmad2/3 水平顯著升高。同樣,我們對大鼠注射GDF11過表達病毒及陰性對照病毒12天后建立腦缺血再灌注模型,缺血2h再灌注3天后對大鼠缺血半影區(qū)進行取材,通過Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)過表達GDF11預處理使得pSmad2/3水平顯著升高�？傊�,GDF11通過調控Smad2/3信號通路參與腦缺血的預防和治療。實驗結論1、腦缺血再灌注后,GDF11在皮層缺血半影區(qū)表達上調。2、GDF11可以參與治療腦缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷,通過抑制半影區(qū)細胞凋亡的作用機制。3、GDF11在腦缺血再灌注預防中發(fā)揮作用,可通過促進SVZ腦區(qū)細胞增殖,增強周圍血管的再生以及抑制半影區(qū)細胞凋亡方式,減少腦缺血再灌注造成的損傷。4、GDF11在腦缺血防治中的作用是通過調控Smad2/3信號通路實現(xiàn)的。創(chuàng)新點1、GDF11對大鼠腦缺血再灌注所致的損傷具有預防和治療作用。2、GDF11在預防和治療大鼠腦缺血再灌注損傷方面的作用機制不同。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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