發(fā)布時間：2018-02-19 21:54

  本文關鍵詞： 少突膠質細胞 RNA干擾 慢病毒載體 Lingo-1基因 少突膠質細胞 髓鞘堿性蛋白 慢病毒載體 自身免疫性腦脊髓炎 基因沉默 髓鞘形成　出處：《華中科技大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景 多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘性疾病,是青年人常見致殘的神經系統(tǒng)疾病之一。髓鞘再生失敗和軸突損害是MS患者遺留永久神經功能損害的病理基礎,其中反復的髓鞘脫失可以導致軸突損傷。故盡快修復髓鞘,是防止軸突損害和減少殘疾發(fā)生的關鍵。賴氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域(Leucine rich repeat and Ig domain containing1, Lingo-1)是中樞神經系統(tǒng)成髓鞘細胞(少突膠質細胞)分化成熟的負性調控因子。EAE是目前公認的廣泛應用于研究的多發(fā)性硬化動物模型。 本研究通過RNA干擾抑制Lingo-1表達,觀察Lingo-1抑制對少突膠質細胞和EAE的影響并探討其機制,為下一步多發(fā)性硬化Lingo-1阻斷治療做一些有益的嘗試。本研究分三部分。 第一部分Lingo-1shRNA慢病毒載體的構建及篩選 目的：篩選出對小鼠少突膠質細胞Lingo-1表達沉默效率較高的Lingo-1shRNA慢病毒載體。 方法： 1.體外原代培養(yǎng)少突膠質細胞,取材自新生48h內小鼠大腦皮質；應用不同分離純化方法后測定細胞存活率和純度,摸索較為理想的細胞獲取方法；并進行Lingo-1、MBP免疫熒光鑒定。 2.將編碼Lingo-1shRNA慢病毒載體轉導少突膠質細胞后,對轉導后的細胞行MTT細胞增殖實驗,觀察轉導對細胞生存的影響。 3.轉導后96h應用RT-qPCR方法檢測了Lingo-1mRNA水平的變化；應用Western blot方法檢測Lingo-1蛋白質水平的變化；應用免疫細胞熒光,觀察轉導后少突膠質細胞上Lingo-1的表達并計數(shù)細胞Lingo-1陽性率；篩選出抑制效果最佳的Lingo-1shRNA慢病毒載體。 結果： 1.原代培養(yǎng)的小鼠少突膠質細胞經輕度胰酶消化+短時間振蕩法和振蕩分離法兩種不同分離純化方法細胞純度相近(P0.05),但輕度胰酶消化+短時間振蕩法細胞存活率更高(96.46+2.26%vs80.25+1.55%,P0.05)。培養(yǎng)細胞經Lingo-1、MBP免疫細胞熒光染色鑒定為陽性。 2.MTT實驗顯示Lingo-1shRNA慢病毒轉導少突膠質細胞后,干擾組與正常組少突膠質細胞OD值間沒有顯著差異(P0.05)。 3.少突膠質細胞轉導Lingo-1shRNA慢病毒96h后,LV/Lingo-1shRNA(1)組和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1mRNA的沉默效率分別為36%和37%,明顯高于其它組(P0.05, P0.05); LV/Lingo-1shRNA(1)組和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1蛋白的沉默效率分別為27.6%和28.3%,明顯高于其它組(P0.05,P0.05)；免疫細胞熒光染色也顯示LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1蛋白含量明顯減少。 結論： LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)為較高沉默效率的慢病毒載體,且對細胞生存率無明顯影響。LV/Lingo-1shRNA(2)用于后續(xù)的RNA干擾研究。 第二部分Lingo-1shRNA慢病毒載體對少突膠質細胞的影響 目的：探討Lingo-1shRNA慢病毒載體對小鼠少突膠質細胞的影響。 方法： 1.應用抑制效果最佳的LV/Lingo-1shRNA (2)轉導少突膠質細胞,應用RT-qPCR、 Western blot方法檢測轉導后第1、3、7、14天Lingo-1mRNA和蛋白的表達,并和空白對照組、陰性對照組比較,觀察LV/Lingo-1shRNA(2)在不同時間的沉默效率。 2.應用Western blot方法檢測轉導后第1、3、5、7天少突膠質細胞MBP蛋白表達；應用細胞免疫熒光,計數(shù)轉導后不同時間少突膠質細胞MBP陽性率,了解Lingo-1shRNA慢病毒載體對少突膠質細胞分化成熟過程的影響。 3.應用Western blot方法檢測p-RhoA蛋白質水平的變化,探討Lingo-1shRNA的可能作用通路。 結果： 1.少突膠質細胞轉導LV/Lingo-1shRNA(2)后第3、7、14天,干擾組的Lingo-1mRNA的沉默效率為13.2%、45.1%和57.0%,顯著高于對照組(P0.05,P0.05,P0.05)；第3、7、14天,干擾組的Lingo-1蛋白的沉默效率為27%、47%和53%,顯著高于對照組(P0.05,P0.01,P0.01)。 2. LV/Lingo-1shRNA (2)干擾后第1天、第7天少突膠質細胞MBP蛋白與對照組相比無顯著差異,第3天和第5天MBP蛋白的表達顯著增加(2.29±0.13vs1.23±0.08)(2.64±0.21vs1.31±0.11)(P0.01, P0.01)。LV/Lingo-lshRNA(2)干擾后第1天干擾組MBP陽性率為(45.4±5.5)%,與空白對照組無明顯差異(P0.05)。第3、5天干擾組MBP陽性率分別為(89.7±7.9)%和(99.6±4.6)%,明顯高于對照組(P0.01,P(0.05)。 3. LV/Lingo-1shRNA(2)干擾后24h、48h、72h、96h,干擾組和空白對照組之間p-RhoA蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論：LV/Lingo-1shRNA對少突膠質細胞中Lingo-1的沉默效率在一定時間內呈逐漸增強趨勢。沉默Lingo-1促體外培養(yǎng)的少突膠質細胞更早更快成熟。 第三部分沉默Lingo-1基因表達對自身免疫性腦脊髓炎的影響 目的：探討沉默LINGO-1表達對EAE小鼠運動功能和髓鞘恢復的影響。 方法： 1.建立EAE小鼠模型,通過RT-PCR、Western-Blot方法,檢測了造模成功后第1、3、7、14、21、30天腦組織內Lingo-1的變化,并和正常小鼠比較。 2.造模成功評分在2-3分之間的EAE小鼠,隨機分為5組：側腦室注入5ul滴度為5×109Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)組,側腦室注入5ul滴度為5×108Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)組,側腦室注入5ul滴度為5×107Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA (2)組,側腦室注入5ulLVCON053組和未治療組；通過RT-PCR、Western-Blot方法,檢測轉導后不同時間各組腦組織內Lingo-1的變化。 3.對不同組的EAE小鼠進行運動功能評分及髓鞘快藍染色,探討側腦室注入Lingo-1shRNA慢病毒載體對EAE小鼠運動功能恢復及髓鞘形成的作用。 結果： 1.小鼠多在誘導后7-10天左右發(fā)病,總發(fā)病率為81.3%,平均臨床評分為2.45±0.94分。EAE模型組小鼠造模成功第1、3、7、14、21天LINGO-1mRNA和蛋自表達較對照組和佐劑組有明顯上調,LINGO-1蛋白表達在第7天上調最為明顯(P0.01),其后逐漸下降,至第30天時仍略高于對照組。EAE小鼠LINGO-1mRNA的峰值則出現(xiàn)在第1天,第30天其值接近對照組(P0.05)。 2.在LV/Lingo-1-shRNA注入后第3天開始,5×107、5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組Lingo-lmRNA表達明顯降低(2.45±0.15,2.06±0.18,2.14±0.08vs2.80±0.10,P0.05)；在第14天5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組Lingo-1mRNA已降至接近于正常水平(1.19±0.11,1.46±0.10vs1.03±0.09, P0.05,P0.05)。5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組在第30天Lingo-1mRNA表達也接近于正常值(1.25±0.06vs1.03±0.12,P0.05)。在Lingo-1蛋白表達方面,5×107、5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA組EAE小鼠從第7天開始均有明顯下調(2.53±0.10,1.99±0.13,2.08±0,10vs3.14±0.06, P0.05, P0.01, P0.01),第21天5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA組Lingo-1蛋白已降至接近正常水平(1.14±0.10,1.15±0.03vs1.01±0.03,P0.05,P0.05)。 3.側腦室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后,相比較于LVCON053組和未治療組,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA、5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA三組從第7天開始運動功能評分有不同程度的下降(3.11±0.13,2.42±0.13,2.96±0.10vs3.56±0.15,3.87±0.12,P0.01,P0.01, P0.05)。其中,5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組運動功能改善最明顯。 4.側腦室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后第30天,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組和5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組髓鞘密度明顯高于未治療組(P0.05,P0.01),其中5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組髓鞘修復最佳,但仍未達正常水平(P0.05)。 結論：側腦室注射LV/Lingo-1shRNA是一種沉默EAE小鼠腦內Lingo-1表達的有效方式。Lingo-1下調可改善EAE小鼠運動功能及促髓鞘修復,但效果并不隨LV/Lingo-1-shRNA劑量增加而增強。
[Abstract]:Research background
Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of central nervous system, is one of the common diseases of the nervous system of young people and disability. Remyelination failure and axonal injury is the pathological basis of MS patients left permanent neurological damage, which can lead to repeated demyelination axonal injury. So fixed as soon as possible to prevent the damage of axonal remyelination, and the key to reducing disability. Lysine repeats and immunoglobulin domains (Leucine rich repeat and Ig domain containing1, Lingo-1) is a central nervous system myelination cells (oligodendrocyte differentiation) negative regulatory factor.EAE is present in multiple sclerosis animal recognized are widely used in the study model.
In this study, we inhibit Lingo-1 expression through RNA interference, observe the effect of Lingo-1 inhibition on oligodendrocytes and EAE, and explore its mechanism, so as to make some useful attempts for the next Lingo-1 treatment of multiple sclerosis. This study is divided into three parts.
The first part of the construction and screening of Lingo-1shRNA lentivirus vector
Objective: to screen the Lingo-1shRNA lentivirus vector with high expression silencing efficiency in mouse oligodendrocyte Lingo-1.
Method錛，

本文編號：1518076