本文關(guān)鍵詞： 環(huán)狀RNA 高通量測(cè)序 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 生物信息學(xué)分析 膠質(zhì)瘤 circBRAF PFS OS 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 膠質(zhì)瘤 circBRAF 遷移 侵襲　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。目前針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)切除、放射治療及以替莫唑胺為主的化療,縱使經(jīng)過(guò)手術(shù)及術(shù)后的放化療,高級(jí)別膠質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后仍非常差,嚴(yán)重威脅人類生命健康。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)步,人們對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)也逐步深入。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,進(jìn)而尋找早期診斷、預(yù)后判斷及治療靶點(diǎn)的新的分子標(biāo)記物具有重要意義。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類單鏈的閉合的環(huán)狀非編碼RNA,既沒有5’端,也沒有3’端的多聚A尾。由于它特殊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),使它不會(huì)被RNA酶降解,在進(jìn)化上存在保守性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)或miRNA海綿而發(fā)揮重要作用�；赾ircRNAs的這些特點(diǎn),對(duì)circRNAs的研究可能為藥物的開發(fā)提供新思路,為研究生命的進(jìn)化提供新方向,作為一種生物標(biāo)志物。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,運(yùn)用這一技術(shù)篩選出了大量腫瘤中差異表達(dá)的circRNAs,并為后續(xù)的深入研究中揭示了部分circRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。這些研究主要集中在肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等,circRNAs在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能研究較少。因此,我們運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和5例正常腦組織進(jìn)行了circRNA測(cè)序,構(gòu)建了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的circRNAs表達(dá)譜,并比較計(jì)算出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中差異表達(dá)的circRNAs。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)的circRNAs生物信息學(xué)分析,推測(cè)其可能發(fā)揮的作用。從而為闡明膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。根據(jù)差異表達(dá)的circRNAs的生物信息分析結(jié)果,我們從下調(diào)表達(dá)的circRNAs中挑選了一個(gè)circRNAs在68例不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤和13例正常腦組織中驗(yàn)證其表達(dá)水平,并與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后行相關(guān)性分析。另外我們利用質(zhì)粒載體構(gòu)建了過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,并對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251轉(zhuǎn)染,進(jìn)行一系列功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)該circRNAs后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性的影響,為今后以circRNAs為切入點(diǎn)的膠質(zhì)瘤的診斷與治療進(jìn)行初步探索。第一部分環(huán)狀RNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與正常腦組織中的差異表達(dá)及生物信息學(xué)分析目的:構(gòu)建膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和正常腦組織中circRNAs的表達(dá)譜,分析差異表達(dá)的circRNAs可能的作用,為后續(xù)靶定研究與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的circRNAs提供基礎(chǔ)。方法:對(duì)5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和5例正常腦組織提取總RNA,使用circRNA Enrichment Kit(cloud-seq,USA)富集circRNAs,用truseq stranded total RNA library prep kit(Illumina,San Diego,CA,USA)預(yù)處理RNA并構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)(10個(gè)),將文庫(kù)變性為單鏈DNA分子,在Illuminaflowcell上捕獲并原位擴(kuò)增為簇,運(yùn)用Illumina HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行150循環(huán)的circRNAs測(cè)序,獲取經(jīng)過(guò)質(zhì)控后的雙端reads,用STAR軟件將這些reads比對(duì)到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組(Hg19)上,運(yùn)用DCC軟件行circRNAs檢測(cè)和鑒定,并運(yùn)用circBase和circ2Trait數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所鑒定的circRNAs進(jìn)行注釋。使用總reads對(duì)每個(gè)樣品的原始junction reads進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。運(yùn)用t-test計(jì)算circRNAs在兩組間差異的顯著性,取差異倍數(shù)大于等于2倍且p≤0.05的circRNAs。對(duì)差異circRNAs的來(lái)源基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析,并用mi RNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和Miranda進(jìn)行circRNAs-microRNA相互作用預(yù)測(cè),使用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNAs-microRNA網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果:在10個(gè)組織標(biāo)本中共有50386個(gè)circRNAs,其中有1411個(gè)circRNAs在兩組間表達(dá)有顯著性差異,206個(gè)circRNAs在GBM組上調(diào)表達(dá),1205個(gè)circRNAs在GBM組下調(diào)表達(dá)。GO分析顯示在腫瘤組上調(diào)表達(dá)的circRNAs在生物學(xué)途徑涉及了生物學(xué)途徑(BP)35項(xiàng),細(xì)胞組份(CC)31項(xiàng),分子功能(MF)12條目。下調(diào)表達(dá)的circRNAs在BP涉及了663項(xiàng),CC146項(xiàng),MF150項(xiàng)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的circRNAs沒有富集的信號(hào)通路,而下調(diào)表達(dá)的circRNAs共有70條信號(hào)通路。circRNAs-microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示,一個(gè)circRNAs可對(duì)應(yīng)多個(gè)microRNA,而一個(gè)microRNA也可以與多個(gè)circRNAs有相互作用關(guān)系。結(jié)論:(1)在GBM和正常腦組織中circRNAs存在非常大量circRNAs,且存在大量差異表達(dá)的circRNAs,這些差異表達(dá)的circRNAs可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。(2)差異表達(dá)circRNAs的GO分析和KEGG通路分析顯示它們可能參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞增殖及多種腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程,總體上反映了circRNAs在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。(3)、circRNAs-microRNA網(wǎng)絡(luò)圖提示circRNAs與microRNA有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系,其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。第二部分環(huán)狀RNA circBRAF在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系研究目的:比較circBRAF在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況,并分析circBRAF的表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性。方法:用realtime PCR的方法檢測(cè)circBRAF在68例不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤及13例正常腦組織中的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:circBRAF的表達(dá)水平在正常腦組織中明顯高于腫瘤組織中,且與腫瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)(p0.01),生存分析顯示circBRAF的表達(dá)水平與無(wú)進(jìn)展生存(PFS)及總體生存(OS)呈正相關(guān)。結(jié)論:circBRAF的表達(dá)量隨腫瘤級(jí)別的增高而降低,且與患者預(yù)后呈明顯的正相關(guān),因此我們推測(cè)circBRAF表達(dá)下降促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生。第三部分環(huán)狀RNA circBRAF在腦膠質(zhì)瘤中的功能研究目的:初步研究探討過(guò)表達(dá)circBRAF在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中的功能方法:構(gòu)建circBRAF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)染使U251細(xì)胞過(guò)表達(dá)circBRAF基因,運(yùn)用realtime PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時(shí)后行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)circBRAF后對(duì)U251細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。結(jié)果:U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染circBRAF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后circBRAF表達(dá)量明顯增多。transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)circBRAF后,細(xì)胞的遷移能力明顯下降;transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)circBRAF后,細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。結(jié)論:過(guò)表達(dá)circBRAF的表達(dá)后能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的遷移與侵襲能力。
[Abstract]:In recent years , we used high - throughput sequencing to study the molecular mechanism of glioma . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . Objective : To investigate the expression of BRAF in glioma cell line U251 and to investigate the relationship between expression level and prognosis of glioma cell line U251 .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1510334