本文關(guān)鍵詞： 人源脂肪干細胞 誘導(dǎo)性多能干細胞 神經(jīng)干細胞 缺血性腦卒中 大腦中動脈栓塞(MCAO)模型　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人源脂肪干細胞(h ADSCs)和人誘導(dǎo)多能干細胞(hi PSCs)來源的神經(jīng)干細胞(NSCs)這兩種干細胞都被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細胞,然而目前尚未見h ADSCs和hi PSC來源的NSCs修復(fù)缺血性腦卒中效果及機制比較的相關(guān)報道。為利用干細胞和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS)提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持,本課題旨在探討哪種干細胞能更好地修復(fù)腦梗死及其調(diào)控相關(guān)機制。本課題分為體外試驗和體內(nèi)實驗兩部分。體外試驗包括脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定,人i PSCs培養(yǎng)及向NSC誘導(dǎo)分化,應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)對分化后的細胞進行NSC標(biāo)志物Nestin、Sox2的表達鑒定;體內(nèi)實驗通過將慢病毒標(biāo)記后的h ADSCs和hi PSC來源的NSC分別立體定向移植至用改良方法建立的小鼠大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)腦卒中模型,觀察這兩種干細胞對小鼠缺血性腦損傷所致神經(jīng)功能缺陷的修復(fù)作用,用5級評分法對其進行神經(jīng)功能評分,并用水迷宮實驗(Morris test)檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變情況,免疫熒光染色追蹤比較h ADSCs及hi PSC-NSCs在腦內(nèi)的遷移方向、分化去向及功能整合情況,同時探討這兩種干細胞治療腦損傷的相關(guān)機制。本論文包括以下兩部分共三個章節(jié):體外實驗第一章脂肪干細胞的分離培養(yǎng)、擴增及表型鑒定目的:為獲取穩(wěn)定傳代的脂肪干細胞來源,擬建立一種成熟且穩(wěn)定的h ADSCs體外分離、培養(yǎng)方法,并了解其生物學(xué)特性。方法:利用貼壁培養(yǎng)法獲得原代培養(yǎng)的h ADSCs,并傳代擴增培養(yǎng),選取第三至第五代的細胞采用細胞流式技術(shù)對脂肪干細胞表面標(biāo)志物進行鑒定。結(jié)果:貼壁法原代培養(yǎng)h ADSCs兩周后,用顯微鏡觀察貼壁h ADSCs生長情況,細胞形態(tài)呈典型的梭形漩渦樣。分離純化的h ADSCs利用表面標(biāo)志物CD44,CD45,CD19,CD73,CD105,CD11b,CD34和HLA-DR等進行免疫熒光鑒定,采用流式細胞技術(shù)對h ADSCs免疫表型進行鑒定,鑒定結(jié)果為h ADSCs表達間充質(zhì)干細胞標(biāo)記物CD44(100%),CD73(100%),CD90(100%),CD105(99.5%)和CD73CD105(99.5%),然而h ADSCs幾乎不表達造血干細胞標(biāo)志物如CD34,CD45,CD19,CD11b和HLA-DR(所有3%)。本實驗結(jié)果表明,分離、培養(yǎng)的h ADSCs具有間充質(zhì)干細胞的特性,其相對純度高于97%。在體外實驗中,利用不同系統(tǒng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)h ADSCs向三系分化,體現(xiàn)了其多向分化潛能,如用油紅O(Oil Red O)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為脂肪細胞,茜素(Alizarin)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為成骨細胞,甲苯胺藍(Alcian blue)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為軟骨細胞。結(jié)論:本課題建立了成熟穩(wěn)定的人源脂肪干細胞體外培養(yǎng)體系。分離、培養(yǎng)的h ADSCs不僅具有多向分化潛能還具有很強的體外擴增能力及間充質(zhì)干細胞的特性。目前,在再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中,h ADSCs被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細胞。第二章hi PSCs的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為NSC目的:為了獲得穩(wěn)定傳代的hi PSCs及hi PSCs來源的NSC,了解其生物學(xué)特性,用于移植修復(fù)缺血性腦損傷。方法:本實驗組采用成熟穩(wěn)定的培養(yǎng)及分化體系,培養(yǎng)hi PSCs細胞并誘導(dǎo)其定向分化為NSC,采用免疫熒光染色技術(shù)對分化后的細胞,對細胞標(biāo)志物Nestin、Sox2的表達進行鑒定。同時,采用無血清無重組人堿性成纖維細胞生長因子(b FGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對hi PSCs來源的NSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞,采用免疫熒光染色對細胞標(biāo)志物TUJ1、GFAP的表達進一步鑒定。結(jié)果:獲得成功誘導(dǎo)分化的NSC。加入無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基21天后,在顯微鏡下可觀察到貼壁生長的細胞球形成典型的神經(jīng)Rosette結(jié)構(gòu),采用免疫熒光染色,細胞球呈Nestin及Sox2陽性表達,貼壁培養(yǎng)21天后,細胞形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),免疫熒光鑒定顯示細胞高表達Nestin、Sox2標(biāo)志物。無血清無重組人堿性成纖維細胞生長因子(b FGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后,細胞球分化形成大量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。通過免疫熒光染色鑒定細胞標(biāo)志物Nestin、SOX2、TUJ1及GFAP的表達,結(jié)果顯示hi PSCs來源的NSC可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞。結(jié)論:本課題組已成功建立了hiPSCs來源的NSC成熟穩(wěn)定的培養(yǎng)及分化體系,獲得的NSC具有較強的向神經(jīng)系統(tǒng)分化的潛能,具有神經(jīng)干細胞的性質(zhì),在目前的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中,hi PSCs-NSC也被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細胞。體內(nèi)實驗第三章脂肪干細胞與多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞治療小鼠缺血性腦卒中的療效評估目的:建立成熟穩(wěn)定的缺血性腦卒中(MCAO)模型,評估比較兩種不同干細胞對動物神經(jīng)功能損傷的修復(fù)效果,為干細胞的臨床應(yīng)用和再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化提供實驗支持。方法:選用SPF級C57/BL6 4-6周雌性小鼠,體重在16-18g左右。通過5級動物神經(jīng)功能行為評分及活體組織實驗驗證線栓法建立的小鼠MCAO模型是否成功。實驗動物隨機分為4組:h ADSCs組、i PSC-NSCs組、PBS組和Sham組。具體方法是,動物行為學(xué)評分評估建立模型后14天內(nèi)所有動物每天的行為狀況。建模成功7天后通過原位注射的方式緩慢微量多點地分別注射用表達增強型綠色熒光的慢病毒(FG12)感染標(biāo)記的h ADSCs(106細胞/只)、hi PSC-NSCs(106細胞/只)到h ADSCs組、hi PSC-NSCs組,用相同的方式注射相同體積的PBS到對照組,Sham組不注射任何物質(zhì)。接下來,用5級評分法(Zea Longa 5-grade scale)評估小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。在細胞移植術(shù)后35天,采用水迷宮實驗(Morris test)評估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)情況,TTC染色評估小鼠大腦的梗死面積。結(jié)果:96%的小鼠存活,建模成功的小鼠神經(jīng)功能評分均在2-3分,采用TTC染色表明梗死部位及梗死灶區(qū)域大小一致。分別移植hi PSC-NSCs和h ADSCs至小鼠腦組織內(nèi)后能夠長期存活,免疫熒光染色顯示移植35天后的移植區(qū)和腦損傷區(qū)均可見熒光標(biāo)記的表達神經(jīng)細胞標(biāo)志物GFAP、Iba1的移植細胞,可見移植后的細胞能夠遷移到缺血灶部位并分化為神經(jīng)細胞;注射細胞組評分結(jié)果明顯低于MCAO-PBS未注射細胞組,注射細胞組與MCAO-PBS未注射細胞組的評分結(jié)果有顯著性差異,(P0.05);而MCAO-hi PSCs-NSC-EGFP組神經(jīng)功能缺損評分與MCAO-h ADSC-EGFP組相比評分結(jié)果無顯著性差異,(P0.05)。此外,水迷宮實驗結(jié)果證明hi PSCs來源的NSC和h ADSCs可以改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,注射細胞組空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯較細胞移植前好,同一時間節(jié)點較MCAO-PBS組好(P0.05);而MCAO-hi PSC-NSC-EGFP組學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)與MCAO-h ADSC-EGFP組比較無顯著性差異(P0.05)結(jié)論:MCAO模型是一種可重復(fù)率高、穩(wěn)定性好的小鼠腦缺血模型;分別原位注射移植hi PSC來源的NSCs和h ADSCs至小鼠腦內(nèi),可定向遷移至腦缺血區(qū)并分化為神經(jīng)細胞并長期存活。hi PSC-NSCs與h ADSCs均明顯促進小鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù),而兩者治療效果無明顯差異。
[Abstract]:In order to provide new theoretical and technical support for the treatment of ischemic cerebrovascular diseases ( CNS ) by using stem cell and regenerative medicine technique , this study was divided into two parts : isolation , culture and identification of adipose - derived stem cells , the differentiation and the differentiation of the neural stem cells . The results showed that h ADSCs were cultured in vitro . The results showed that h ADSCs were cultured in vitro . The expression of Nestin , SOX2 , TUJ1 and GFAP was determined by immunofluorescence staining . The results showed that the neural functional score of the mice after transplantation was significantly lower than that in the middle cerebral ischemia - reperfusion group ( P0.05 ) . The results showed that the neural function recovery of the mice after transplantation was significantly lower than that in the middle cerebral ischemia - reperfusion group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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1 馮年花;謝安;婁遠蕾;阮瓊芳;郭菲;楊陽;潘長福;鄧志鋒;汪泱;;人誘導(dǎo)性多能干細胞向神經(jīng)干細胞分化的方法探討[J];中國病理生理雜志;2010年08期

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本文編號：1506857