本文關(guān)鍵詞： 人源脂肪干細(xì)胞 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 缺血性腦卒中 大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人源脂肪干細(xì)胞(h ADSCs)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hi PSCs)來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)這兩種干細(xì)胞都被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細(xì)胞,然而目前尚未見h ADSCs和hi PSC來(lái)源的NSCs修復(fù)缺血性腦卒中效果及機(jī)制比較的相關(guān)報(bào)道。為利用干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS)提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持,本課題旨在探討哪種干細(xì)胞能更好地修復(fù)腦梗死及其調(diào)控相關(guān)機(jī)制。本課題分為體外試驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分。體外試驗(yàn)包括脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定,人i PSCs培養(yǎng)及向NSC誘導(dǎo)分化,應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行NSC標(biāo)志物Nestin、Sox2的表達(dá)鑒定;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)將慢病毒標(biāo)記后的h ADSCs和hi PSC來(lái)源的NSC分別立體定向移植至用改良方法建立的小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)腦卒中模型,觀察這兩種干細(xì)胞對(duì)小鼠缺血性腦損傷所致神經(jīng)功能缺陷的修復(fù)作用,用5級(jí)評(píng)分法對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,并用水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris test)檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變情況,免疫熒光染色追蹤比較h ADSCs及hi PSC-NSCs在腦內(nèi)的遷移方向、分化去向及功能整合情況,同時(shí)探討這兩種干細(xì)胞治療腦損傷的相關(guān)機(jī)制。本論文包括以下兩部分共三個(gè)章節(jié):體外實(shí)驗(yàn)第一章脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增及表型鑒定目的:為獲取穩(wěn)定傳代的脂肪干細(xì)胞來(lái)源,擬建立一種成熟且穩(wěn)定的h ADSCs體外分離、培養(yǎng)方法,并了解其生物學(xué)特性。方法:利用貼壁培養(yǎng)法獲得原代培養(yǎng)的h ADSCs,并傳代擴(kuò)增培養(yǎng),選取第三至第五代的細(xì)胞采用細(xì)胞流式技術(shù)對(duì)脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。結(jié)果:貼壁法原代培養(yǎng)h ADSCs兩周后,用顯微鏡觀察貼壁h ADSCs生長(zhǎng)情況,細(xì)胞形態(tài)呈典型的梭形漩渦樣。分離純化的h ADSCs利用表面標(biāo)志物CD44,CD45,CD19,CD73,CD105,CD11b,CD34和HLA-DR等進(jìn)行免疫熒光鑒定,采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)h ADSCs免疫表型進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果為h ADSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD44(100%),CD73(100%),CD90(100%),CD105(99.5%)和CD73CD105(99.5%),然而h ADSCs幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物如CD34,CD45,CD19,CD11b和HLA-DR(所有3%)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,分離、培養(yǎng)的h ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,其相對(duì)純度高于97%。在體外實(shí)驗(yàn)中,利用不同系統(tǒng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)h ADSCs向三系分化,體現(xiàn)了其多向分化潛能,如用油紅O(Oil Red O)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞,茜素(Alizarin)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞,甲苯胺藍(lán)(Alcian blue)染色鑒定培養(yǎng)的h ADSCs誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞。結(jié)論:本課題建立了成熟穩(wěn)定的人源脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。分離、培養(yǎng)的h ADSCs不僅具有多向分化潛能還具有很強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力及間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。目前,在再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中,h ADSCs被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細(xì)胞。第二章hi PSCs的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為NSC目的:為了獲得穩(wěn)定傳代的hi PSCs及hi PSCs來(lái)源的NSC,了解其生物學(xué)特性,用于移植修復(fù)缺血性腦損傷。方法:本實(shí)驗(yàn)組采用成熟穩(wěn)定的培養(yǎng)及分化體系,培養(yǎng)hi PSCs細(xì)胞并誘導(dǎo)其定向分化為NSC,采用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)分化后的細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、Sox2的表達(dá)進(jìn)行鑒定。同時(shí),采用無(wú)血清無(wú)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b FGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)hi PSCs來(lái)源的NSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,采用免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞標(biāo)志物TUJ1、GFAP的表達(dá)進(jìn)一步鑒定。結(jié)果:獲得成功誘導(dǎo)分化的NSC。加入無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基21天后,在顯微鏡下可觀察到貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞球形成典型的神經(jīng)Rosette結(jié)構(gòu),采用免疫熒光染色,細(xì)胞球呈Nestin及Sox2陽(yáng)性表達(dá),貼壁培養(yǎng)21天后,細(xì)胞形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),免疫熒光鑒定顯示細(xì)胞高表達(dá)Nestin、Sox2標(biāo)志物。無(wú)血清無(wú)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b FGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后,細(xì)胞球分化形成大量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)免疫熒光染色鑒定細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、SOX2、TUJ1及GFAP的表達(dá),結(jié)果顯示hi PSCs來(lái)源的NSC可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論:本課題組已成功建立了hiPSCs來(lái)源的NSC成熟穩(wěn)定的培養(yǎng)及分化體系,獲得的NSC具有較強(qiáng)的向神經(jīng)系統(tǒng)分化的潛能,具有神經(jīng)干細(xì)胞的性質(zhì),在目前的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中,hi PSCs-NSC也被認(rèn)為是治療腦卒中的理想種子細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)第三章脂肪干細(xì)胞與多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞治療小鼠缺血性腦卒中的療效評(píng)估目的:建立成熟穩(wěn)定的缺血性腦卒中(MCAO)模型,評(píng)估比較兩種不同干細(xì)胞對(duì)動(dòng)物神經(jīng)功能損傷的修復(fù)效果,為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)支持。方法:選用SPF級(jí)C57/BL6 4-6周雌性小鼠,體重在16-18g左右。通過(guò)5級(jí)動(dòng)物神經(jīng)功能行為評(píng)分及活體組織實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證線栓法建立的小鼠MCAO模型是否成功。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組:h ADSCs組、i PSC-NSCs組、PBS組和Sham組。具體方法是,動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分評(píng)估建立模型后14天內(nèi)所有動(dòng)物每天的行為狀況。建模成功7天后通過(guò)原位注射的方式緩慢微量多點(diǎn)地分別注射用表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光的慢病毒(FG12)感染標(biāo)記的h ADSCs(106細(xì)胞/只)、hi PSC-NSCs(106細(xì)胞/只)到h ADSCs組、hi PSC-NSCs組,用相同的方式注射相同體積的PBS到對(duì)照組,Sham組不注射任何物質(zhì)。接下來(lái),用5級(jí)評(píng)分法(Zea Longa 5-grade scale)評(píng)估小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。在細(xì)胞移植術(shù)后35天,采用水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris test)評(píng)估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)情況,TTC染色評(píng)估小鼠大腦的梗死面積。結(jié)果:96%的小鼠存活,建模成功的小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均在2-3分,采用TTC染色表明梗死部位及梗死灶區(qū)域大小一致。分別移植hi PSC-NSCs和h ADSCs至小鼠腦組織內(nèi)后能夠長(zhǎng)期存活,免疫熒光染色顯示移植35天后的移植區(qū)和腦損傷區(qū)均可見熒光標(biāo)記的表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、Iba1的移植細(xì)胞,可見移植后的細(xì)胞能夠遷移到缺血灶部位并分化為神經(jīng)細(xì)胞;注射細(xì)胞組評(píng)分結(jié)果明顯低于MCAO-PBS未注射細(xì)胞組,注射細(xì)胞組與MCAO-PBS未注射細(xì)胞組的評(píng)分結(jié)果有顯著性差異,(P0.05);而MCAO-hi PSCs-NSC-EGFP組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與MCAO-h ADSC-EGFP組相比評(píng)分結(jié)果無(wú)顯著性差異,(P0.05)。此外,水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明hi PSCs來(lái)源的NSC和h ADSCs可以改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,注射細(xì)胞組空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯較細(xì)胞移植前好,同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)較MCAO-PBS組好(P0.05);而MCAO-hi PSC-NSC-EGFP組學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)與MCAO-h ADSC-EGFP組比較無(wú)顯著性差異(P0.05)結(jié)論:MCAO模型是一種可重復(fù)率高、穩(wěn)定性好的小鼠腦缺血模型;分別原位注射移植hi PSC來(lái)源的NSCs和h ADSCs至小鼠腦內(nèi),可定向遷移至腦缺血區(qū)并分化為神經(jīng)細(xì)胞并長(zhǎng)期存活。hi PSC-NSCs與h ADSCs均明顯促進(jìn)小鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù),而兩者治療效果無(wú)明顯差異。
[Abstract]:In order to provide new theoretical and technical support for the treatment of ischemic cerebrovascular diseases ( CNS ) by using stem cell and regenerative medicine technique , this study was divided into two parts : isolation , culture and identification of adipose - derived stem cells , the differentiation and the differentiation of the neural stem cells . The results showed that h ADSCs were cultured in vitro . The results showed that h ADSCs were cultured in vitro . The expression of Nestin , SOX2 , TUJ1 and GFAP was determined by immunofluorescence staining . The results showed that the neural functional score of the mice after transplantation was significantly lower than that in the middle cerebral ischemia - reperfusion group ( P0.05 ) . The results showed that the neural function recovery of the mice after transplantation was significantly lower than that in the middle cerebral ischemia - reperfusion group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮年花;謝安;婁遠(yuǎn)蕾;阮瓊芳;郭菲;楊陽(yáng);潘長(zhǎng)福;鄧志鋒;汪泱;;人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法探討[J];中國(guó)病理生理雜志;2010年08期

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本文編號(hào)：1506857