本文關(guān)鍵詞： 顳葉癲癇 癲癇持續(xù)狀態(tài) 認(rèn)知損害 海馬 FK506 癲癇持續(xù)狀態(tài) 腦水腫 鈣神經(jīng)素 膠質(zhì)纖維酸性蛋白 膠質(zhì)增生 FK506　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：癲癇是神經(jīng)科常見(jiàn)病,發(fā)病率高,根據(jù)目前的流行病學(xué)資料,我國(guó)的癲癇患者大約在900多萬(wàn)左右,大約25%-30%的患者發(fā)展為難治性癲癇。嚴(yán)重威脅患者本人健康,生活質(zhì)量明顯下降,同時(shí)存在較高的致殘與致死率。癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)為神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)急癥,表現(xiàn)為患者癲癇發(fā)作時(shí)持續(xù)時(shí)間超過(guò)5分鐘,或者患者反復(fù)頻繁癲癇發(fā)作,意識(shí)沒(méi)有完全恢復(fù)。氯化鋰一匹魯卡品癲癇模型作為經(jīng)典的顳葉癲癇動(dòng)物模型,該模型的行為學(xué)及腦電圖改變,與人類癲癇持續(xù)狀態(tài)和顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)相似,是目前研究SE和復(fù)雜部分性發(fā)作最常用的模型之一。研究證實(shí),癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致一系列病理生理變化,可導(dǎo)致腦組織神經(jīng)化學(xué)改變,如局灶性腦水腫,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)元凋亡壞死等。在其一系列病理生理改變中,鈣離子及鈣依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮著重要作用,其中又以神經(jīng)素(calcineurin, CaN)的作用尤為重要。癲癇發(fā)作可引起鈣離子在胞內(nèi)的濃度顯著升高,釋放明顯增加,從而可導(dǎo)致胞內(nèi)鈣神經(jīng)素的激活,引起神經(jīng)元內(nèi)一系列病理改變,導(dǎo)致線粒體功能變化,能量代謝障礙,導(dǎo)致后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng),不僅可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙,同時(shí)會(huì)導(dǎo)致海馬的病理改變,最終導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作,難治性癲癇形成。鈣神經(jīng)素是目前為止發(fā)現(xiàn)的絲／蘇氨酸蛋白激酶家族中唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的磷酸酶,在神經(jīng)系統(tǒng)分布豐富。目前研究發(fā)現(xiàn),鈣神經(jīng)素通過(guò)其脫磷酸作用,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的多種病理生理變化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,如調(diào)節(jié)生物的學(xué)習(xí)與記憶,對(duì)長(zhǎng)時(shí)程記憶發(fā)揮作用,影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。癲癇動(dòng)物模型相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在癲癇的發(fā)病發(fā)展過(guò)程中,可觀察到鈣神經(jīng)素的激活,參與了N-甲基-D-天門冬氨基酸(NMDA)受體活化的過(guò)程,同時(shí)還可調(diào)節(jié)r-氨酸丁酸(GABA)受體介導(dǎo)的抑制性作用,參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),細(xì)胞骨架蛋白合成等一系列過(guò)程,同時(shí)可通過(guò)與鈣蛋白酶、bcl-2相關(guān)死亡蛋白、caspase信號(hào)途徑相關(guān)蛋白等許多凋亡分子之間發(fā)生作用,介導(dǎo)一系列病理生理過(guò)程。還可通過(guò)與一氧化氮合酶(NOS)之間的作用參與神經(jīng)元氧化應(yīng)激過(guò)程。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中,鈣神經(jīng)素含量同樣豐富,同時(shí),在腦外傷,神經(jīng)細(xì)胞老化及淀粉樣變性等多個(gè)病理過(guò)程中,星形膠質(zhì)細(xì)胞中鈣神經(jīng)素的含量明顯升高。FK506因?yàn)榫哂袕?qiáng)大的免疫抑制作用,目前在器官移植后被廣泛應(yīng)用于抑制排斥反應(yīng)。FK506可與FK506結(jié)合蛋白12(FKBP 12)結(jié)合,通過(guò)抑制鈣神經(jīng)素的活性和表達(dá),對(duì)一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生影響。同時(shí),不斷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示,FK506可對(duì)神經(jīng)發(fā)揮保護(hù)作用。通過(guò)大鼠腦缺血模型的研究,FK506可以使腦梗死面積縮小,抑制神經(jīng)元的凋亡,減輕神經(jīng)功能損害。在大鼠癲癇模型中,FK506可減輕癲癇發(fā)作程度,縮短病程,通過(guò)抑制海馬區(qū)神經(jīng)元苔蘚纖維發(fā)芽,減輕癲癇后的海馬組織神經(jīng)元損傷,降低癲癇大鼠死亡率,發(fā)揮抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)作用。雖然目前關(guān)于FK506腦保護(hù)方面的實(shí)驗(yàn)證據(jù)不斷出現(xiàn),但是其具體機(jī)制仍未闡明,尚需進(jìn)一步深入研究。免疫抑制劑雷帕霉素,是一種FK506的衍生物,也可與FKBP 12結(jié)合,但是FKBP 12-雷帕霉素結(jié)合后的復(fù)合物不具備抑制鈣神經(jīng)素活性的生物學(xué)作用,這點(diǎn)與FK506不同。本研究通過(guò)建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力,同時(shí)對(duì)局灶性腦組織水腫進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),檢測(cè)鈣神經(jīng)素及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá),同時(shí)觀察FK506的影響,進(jìn)一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后學(xué)習(xí)記憶障礙、局部腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生中的作用,并探討其可能機(jī)制。為癲癇發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究和臨床治療提供新的思路。本研究分為兩個(gè)部分：第一部分：氯化鋰一匹魯卡品癲癇大鼠模型的建立、病理觀察及FK506對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)、學(xué)習(xí)記憶能力的作用目的：本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察大鼠行為學(xué)變化,并對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行進(jìn)一步的病理學(xué)觀察。同時(shí)觀察FK506對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響,探討FK506在癲癇大鼠模型中的具體作用機(jī)制。方法：1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品,建立大鼠氯化鋰-匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組,分別為正常對(duì)照組,癲癇組(pilo組),FK506組。2.根據(jù)Racine分級(jí),分別記錄大鼠癲癇發(fā)作的程度分級(jí),發(fā)作潛伏期,癲癇發(fā)作起止時(shí)間。3.應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn),觀察致癇大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的變化,并觀察FK506對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響。4.光鏡HE染色觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作后12d海馬神經(jīng)元的變化,包括形態(tài)及數(shù)目的改變,同時(shí)觀察FK506對(duì)其的影響。結(jié)果：1.癲癇組和Fk506組大鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作,開(kāi)始較輕,發(fā)作程度逐漸加重,后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強(qiáng)度的變化。與癲癇組相比,Fk506組大鼠的潛伏期延長(zhǎng),發(fā)作的強(qiáng)度級(jí)別降低。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。2.通過(guò)水迷宮試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),癲癇組潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng),于目標(biāo)象限內(nèi)的游泳距離縮短,次數(shù)減少,提示其存在明顯認(rèn)知功能障礙。K506組大鼠在水迷宮中的潛伏期較癲癇組縮短,可見(jiàn)于目標(biāo)象限內(nèi)的游泳距離延長(zhǎng),于目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間增加,穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)增多。提示FK506能改善癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。3.光鏡下對(duì)照組大鼠海馬未見(jiàn)損害性改變,HE染色示CA3區(qū)錐體神經(jīng)元排列緊密、整齊,分布呈現(xiàn)帶狀,可見(jiàn)清晰完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),胞漿透明,可見(jiàn)圓形或橢圓形的細(xì)胞核,細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻,核仁清晰,形態(tài)正常。SE后12d時(shí)癲癇組大鼠的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度變性、死亡,排列紊亂,數(shù)目減少,部分神經(jīng)元形態(tài)不完整,胞體腫脹、變形、破裂,輪廓模糊、界限不清,壞死的神經(jīng)元胞漿皺縮,紅染,核碎裂甚至消失,失去正常結(jié)構(gòu),伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生；與對(duì)照組相比,FK506組神經(jīng)元也有丟失,數(shù)目減少,但與癲癇組比較,存活神經(jīng)元明顯增多,海馬損傷明顯減輕。結(jié)論：1.氯化鋰—匹魯卡品可成功誘導(dǎo)Wistar大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作,同時(shí)操作簡(jiǎn)單,造模成功率高,可作為癲癇發(fā)病機(jī)制的理想模型,可為新型抗癲癇藥物提供理論依據(jù)。2.癲癇組和Fk506組大鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。Fk506組大鼠的潛伏期延長(zhǎng),發(fā)作的強(qiáng)度級(jí)別降低。提示FK506的抗癲癇作用。3.匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)動(dòng)物模型,其學(xué)習(xí)和空間記憶能力受損。應(yīng)用FK506后可使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)好轉(zhuǎn),提示FK506對(duì)大鼠記憶學(xué)習(xí)能力的保護(hù)作用。4.氯化鋰—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬病理學(xué)觀察可見(jiàn)神經(jīng)元損傷性改變,神經(jīng)元數(shù)量減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷模糊及核固縮等改變,FK 506組大鼠海馬損傷明顯減輕。提示FK506的神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分：FK506抑制鈣神經(jīng)素減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)小鼠腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的研究目的：本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察行為學(xué)變化,核磁共振對(duì)局灶性腦組織掃描觀察腦水腫變化,測(cè)定腦組織水含量,測(cè)定鈣神經(jīng)素及GFAP的表達(dá),同時(shí)觀察免疫抑制劑FK506對(duì)腦組織水腫及鈣神經(jīng)素,GFAP表達(dá)的影響,進(jìn)一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后局部腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生中的作用,并探討其可能機(jī)制。方法：1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨即將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組,為正常對(duì)照組,癲癇組,雷帕霉素組,FK506組。2.根據(jù)Racine分級(jí),分別記錄小鼠癲癇發(fā)作的程度分級(jí),發(fā)作潛伏期,癲癇發(fā)作起止時(shí)間。3.應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)小鼠腦組織掃描,觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)局部腦組織水腫情況。4.應(yīng)用濕—干重法,檢測(cè)癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織的水含量。5.通過(guò)免疫組織化學(xué)染色,觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬神經(jīng)元GFAP的表達(dá),進(jìn)而反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生。6.應(yīng)用Western Blot方法,測(cè)定癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬組織鈣神經(jīng)素(CaN)的表達(dá)變化。結(jié)果：1.癲癇組、Fk506組小鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作,開(kāi)始較輕,發(fā)作程度逐漸加重,后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強(qiáng)度的變化。與癲癇組相比,Fk506組小鼠的潛伏期、發(fā)作的強(qiáng)度級(jí)別無(wú)明顯差異。對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。2.通過(guò)對(duì)各組小鼠在癲癇發(fā)作后的不同時(shí)間點(diǎn)行核磁共振檢查,結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h可見(jiàn)局部腦組織T2像高信號(hào),提示局部腦組織水腫明顯,癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d時(shí)局部腦組織T2像信號(hào)明顯減低,提示腦水腫明顯減輕。FK506可顯著減輕24h時(shí)局部的腦水腫,雷帕霉素未見(jiàn)明顯的抑制作用。3.腦組織的水含量測(cè)定顯示癲癇組,FK506組及雷帕霉素組小鼠的腦組織含水量在癲癇發(fā)作后24h時(shí)明顯升高,7d時(shí)各組小鼠的腦組織含水量恢復(fù)到正常水平。與癲癇組小鼠相比,FK506組小鼠在24h時(shí)的腦組織含水量降低,而雷帕霉素組小鼠未顯示出明顯差異。4.通過(guò)Western blot測(cè)定癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h,72h及7d時(shí)腦組織鈣神經(jīng)素的表達(dá)。結(jié)果提示,鈣神經(jīng)素在癲癇發(fā)作后24h顯著增加,一直持續(xù)到7d。結(jié)果提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達(dá)有關(guān)。5.通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)GFAP的表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體的GFAP是一種細(xì)胞骨架蛋白,可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的狀態(tài),是其特征性的蛋白標(biāo)志,同時(shí)可以特異性的對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果表明,在癲癇發(fā)作后72h時(shí)GFAP表達(dá)增加,7d時(shí)更加明顯。CaN抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達(dá),抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。雷帕霉素組在癲癇后7d時(shí)GFAP表達(dá)比癲癇組低,但比FK506組高,雷帕霉素對(duì)GFAP的抑制作用要弱于FK506。結(jié)果表明鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用,FK506可通過(guò)抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá),發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。結(jié)論：1.通過(guò)核磁共振掃描及腦組織含水量檢測(cè),癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦組織出現(xiàn)明顯腦水腫,發(fā)作后7d時(shí)水腫明顯減輕。FK506可減輕癲癇后腦組織的水腫,發(fā)揮腦保護(hù)作用,雷帕霉素未見(jiàn)明顯的保護(hù)作用。2.癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織鈣神經(jīng)素的表達(dá)在24h顯著增加,一直持續(xù)到7d。CaN抑制劑FK506可顯著減輕24h時(shí)局部的腦水腫,雷帕霉素未見(jiàn)明顯的抑制作用。提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達(dá)有關(guān)。FK506對(duì)腦組織水腫的抑制作用與其抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá)相關(guān)。3.癲癇發(fā)作后GFAP的表達(dá)增加,反映出星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生,CaN抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達(dá),抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。雷帕霉素對(duì)GFAP的抑制作用要弱于FK506。提示鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用,K506可通過(guò)抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá),發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。本課題應(yīng)用氯化鋰—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,研究動(dòng)物行為學(xué),通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和空間記憶能力,通過(guò)7.0T核磁共振對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦部掃描觀察局部腦組織水腫情況,Westblot方法觀察CaN在癲癇發(fā)作后表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變,免疫組化觀察GFAP的表達(dá),同時(shí)觀察癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的損傷。結(jié)果提示：鈣神經(jīng)素抑制劑FK506減輕癲癇發(fā)作,改善學(xué)習(xí)和記憶能力,減輕海馬神經(jīng)元的損傷；核磁共振檢查示癲癇組局部腦組織T2像高信號(hào),提示局部腦組織水腫明顯,鈣神經(jīng)素在癲癇發(fā)作后顯著增加,鈣神經(jīng)素抑制劑FK506可顯著減輕局部的腦水腫,雷帕霉素未見(jiàn)明顯的抑制作用,提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達(dá)有關(guān),FK506通過(guò)抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá),減輕腦組織水腫；鈣神經(jīng)素抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達(dá),抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,雷帕霉素對(duì)GFAP的抑制作用要弱于FK506,表明鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用,K506可通過(guò)抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá),發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。本實(shí)驗(yàn)研究提示鈣神經(jīng)素在癲癇后的認(rèn)知障礙、腦組織水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生中的重要作用,FK506可通過(guò)對(duì)鈣神經(jīng)素的抑制作用,發(fā)揮抗癲癇及腦保護(hù)作用,為癲癇發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究和臨床治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1503524