本文關(guān)鍵詞： 顳葉癲癇 癲癇持續(xù)狀態(tài) 認知損害 海馬 FK506 癲癇持續(xù)狀態(tài) 腦水腫 鈣神經(jīng)素 膠質(zhì)纖維酸性蛋白 膠質(zhì)增生 FK506　出處：《山東大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：癲癇是神經(jīng)科常見病,發(fā)病率高,根據(jù)目前的流行病學資料,我國的癲癇患者大約在900多萬左右,大約25%-30%的患者發(fā)展為難治性癲癇。嚴重威脅患者本人健康,生活質(zhì)量明顯下降,同時存在較高的致殘與致死率。癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)為神經(jīng)內(nèi)科常見急癥,表現(xiàn)為患者癲癇發(fā)作時持續(xù)時間超過5分鐘,或者患者反復頻繁癲癇發(fā)作,意識沒有完全恢復。氯化鋰一匹魯卡品癲癇模型作為經(jīng)典的顳葉癲癇動物模型,該模型的行為學及腦電圖改變,與人類癲癇持續(xù)狀態(tài)和顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)相似,是目前研究SE和復雜部分性發(fā)作最常用的模型之一。研究證實,癲癇持續(xù)狀態(tài)可導致一系列病理生理變化,可導致腦組織神經(jīng)化學改變,如局灶性腦水腫,星形膠質(zhì)細胞活化與神經(jīng)元凋亡壞死等。在其一系列病理生理改變中,鈣離子及鈣依賴性信號傳導途徑發(fā)揮著重要作用,其中又以神經(jīng)素(calcineurin, CaN)的作用尤為重要。癲癇發(fā)作可引起鈣離子在胞內(nèi)的濃度顯著升高,釋放明顯增加,從而可導致胞內(nèi)鈣神經(jīng)素的激活,引起神經(jīng)元內(nèi)一系列病理改變,導致線粒體功能變化,能量代謝障礙,導致后續(xù)級聯(lián)反應,不僅可導致學習記憶等認知功能障礙,同時會導致海馬的病理改變,最終導致癲癇反復發(fā)作,難治性癲癇形成。鈣神經(jīng)素是目前為止發(fā)現(xiàn)的絲／蘇氨酸蛋白激酶家族中唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的磷酸酶,在神經(jīng)系統(tǒng)分布豐富。目前研究發(fā)現(xiàn),鈣神經(jīng)素通過其脫磷酸作用,對神經(jīng)細胞的多種病理生理變化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,如調(diào)節(jié)生物的學習與記憶,對長時程記憶發(fā)揮作用,影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。癲癇動物模型相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在癲癇的發(fā)病發(fā)展過程中,可觀察到鈣神經(jīng)素的激活,參與了N-甲基-D-天門冬氨基酸(NMDA)受體活化的過程,同時還可調(diào)節(jié)r-氨酸丁酸(GABA)受體介導的抑制性作用,參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),細胞骨架蛋白合成等一系列過程,同時可通過與鈣蛋白酶、bcl-2相關(guān)死亡蛋白、caspase信號途徑相關(guān)蛋白等許多凋亡分子之間發(fā)生作用,介導一系列病理生理過程。還可通過與一氧化氮合酶(NOS)之間的作用參與神經(jīng)元氧化應激過程。在星形膠質(zhì)細胞中,鈣神經(jīng)素含量同樣豐富,同時,在腦外傷,神經(jīng)細胞老化及淀粉樣變性等多個病理過程中,星形膠質(zhì)細胞中鈣神經(jīng)素的含量明顯升高。FK506因為具有強大的免疫抑制作用,目前在器官移植后被廣泛應用于抑制排斥反應。FK506可與FK506結(jié)合蛋白12(FKBP 12)結(jié)合,通過抑制鈣神經(jīng)素的活性和表達,對一系列生化反應產(chǎn)生影響。同時,不斷的動物實驗提示,FK506可對神經(jīng)發(fā)揮保護作用。通過大鼠腦缺血模型的研究,FK506可以使腦梗死面積縮小,抑制神經(jīng)元的凋亡,減輕神經(jīng)功能損害。在大鼠癲癇模型中,FK506可減輕癲癇發(fā)作程度,縮短病程,通過抑制海馬區(qū)神經(jīng)元苔蘚纖維發(fā)芽,減輕癲癇后的海馬組織神經(jīng)元損傷,降低癲癇大鼠死亡率,發(fā)揮抗癲癇及神經(jīng)保護作用。雖然目前關(guān)于FK506腦保護方面的實驗證據(jù)不斷出現(xiàn),但是其具體機制仍未闡明,尚需進一步深入研究。免疫抑制劑雷帕霉素,是一種FK506的衍生物,也可與FKBP 12結(jié)合,但是FKBP 12-雷帕霉素結(jié)合后的復合物不具備抑制鈣神經(jīng)素活性的生物學作用,這點與FK506不同。本研究通過建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察實驗動物行為學和學習記憶能力,同時對局灶性腦組織水腫進行相關(guān)檢測,檢測鈣神經(jīng)素及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達,同時觀察FK506的影響,進一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后學習記憶障礙、局部腦水腫及星形膠質(zhì)細胞活化增生中的作用,并探討其可能機制。為癲癇發(fā)病機制的進一步研究和臨床治療提供新的思路。本研究分為兩個部分：第一部分：氯化鋰一匹魯卡品癲癇大鼠模型的建立、病理觀察及FK506對癲癇大鼠行為學、學習記憶能力的作用目的：本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察大鼠行為學變化,并對大鼠海馬神經(jīng)元進行進一步的病理學觀察。同時觀察FK506對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的行為學和學習記憶能力的影響,探討FK506在癲癇大鼠模型中的具體作用機制。方法：1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品,建立大鼠氯化鋰-匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨機將實驗動物分為三組,分別為正常對照組,癲癇組(pilo組),FK506組。2.根據(jù)Racine分級,分別記錄大鼠癲癇發(fā)作的程度分級,發(fā)作潛伏期,癲癇發(fā)作起止時間。3.應用Morris水迷宮試驗,觀察致癇大鼠學習及記憶能力的變化,并觀察FK506對大鼠認知功能的影響。4.光鏡HE染色觀察實驗動物癲癇發(fā)作后12d海馬神經(jīng)元的變化,包括形態(tài)及數(shù)目的改變,同時觀察FK506對其的影響。結(jié)果：1.癲癇組和Fk506組大鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作,開始較輕,發(fā)作程度逐漸加重,后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強度的變化。與癲癇組相比,Fk506組大鼠的潛伏期延長,發(fā)作的強度級別降低。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。2.通過水迷宮試驗我們發(fā)現(xiàn),癲癇組潛伏期較對照組明顯延長,于目標象限內(nèi)的游泳距離縮短,次數(shù)減少,提示其存在明顯認知功能障礙。K506組大鼠在水迷宮中的潛伏期較癲癇組縮短,可見于目標象限內(nèi)的游泳距離延長,于目標象限內(nèi)的游泳時間增加,穿過原平臺位置的次數(shù)增多。提示FK506能改善癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的學習和記憶能力。3.光鏡下對照組大鼠海馬未見損害性改變,HE染色示CA3區(qū)錐體神經(jīng)元排列緊密、整齊,分布呈現(xiàn)帶狀,可見清晰完整的細胞結(jié)構(gòu),胞漿透明,可見圓形或橢圓形的細胞核,細胞核染色質(zhì)分布均勻,核仁清晰,形態(tài)正常。SE后12d時癲癇組大鼠的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度變性、死亡,排列紊亂,數(shù)目減少,部分神經(jīng)元形態(tài)不完整,胞體腫脹、變形、破裂,輪廓模糊、界限不清,壞死的神經(jīng)元胞漿皺縮,紅染,核碎裂甚至消失,失去正常結(jié)構(gòu),伴有膠質(zhì)細胞增生；與對照組相比,FK506組神經(jīng)元也有丟失,數(shù)目減少,但與癲癇組比較,存活神經(jīng)元明顯增多,海馬損傷明顯減輕。結(jié)論：1.氯化鋰—匹魯卡品可成功誘導Wistar大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作,同時操作簡單,造模成功率高,可作為癲癇發(fā)病機制的理想模型,可為新型抗癲癇藥物提供理論依據(jù)。2.癲癇組和Fk506組大鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。Fk506組大鼠的潛伏期延長,發(fā)作的強度級別降低。提示FK506的抗癲癇作用。3.匹魯卡品誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)動物模型,其學習和空間記憶能力受損。應用FK506后可使大鼠的學習記憶能力出現(xiàn)好轉(zhuǎn),提示FK506對大鼠記憶學習能力的保護作用。4.氯化鋰—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬病理學觀察可見神經(jīng)元損傷性改變,神經(jīng)元數(shù)量減少、細胞結(jié)構(gòu)損傷模糊及核固縮等改變,FK 506組大鼠海馬損傷明顯減輕。提示FK506的神經(jīng)保護作用。第二部分：FK506抑制鈣神經(jīng)素減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)小鼠腦水腫及星形膠質(zhì)細胞增生的研究目的：本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,觀察行為學變化,核磁共振對局灶性腦組織掃描觀察腦水腫變化,測定腦組織水含量,測定鈣神經(jīng)素及GFAP的表達,同時觀察免疫抑制劑FK506對腦組織水腫及鈣神經(jīng)素,GFAP表達的影響,進一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后局部腦水腫及星形膠質(zhì)細胞活化增生中的作用,并探討其可能機制。方法：1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨即將實驗動物分為四組,為正常對照組,癲癇組,雷帕霉素組,FK506組。2.根據(jù)Racine分級,分別記錄小鼠癲癇發(fā)作的程度分級,發(fā)作潛伏期,癲癇發(fā)作起止時間。3.應用核磁共振技術(shù)對小鼠腦組織掃描,觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后不同時間點局部腦組織水腫情況。4.應用濕—干重法,檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織的水含量。5.通過免疫組織化學染色,觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬神經(jīng)元GFAP的表達,進而反應星形膠質(zhì)細胞的活化增生。6.應用Western Blot方法,測定癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬組織鈣神經(jīng)素(CaN)的表達變化。結(jié)果：1.癲癇組、Fk506組小鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作,開始較輕,發(fā)作程度逐漸加重,后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強度的變化。與癲癇組相比,Fk506組小鼠的潛伏期、發(fā)作的強度級別無明顯差異。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。2.通過對各組小鼠在癲癇發(fā)作后的不同時間點行核磁共振檢查,結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h可見局部腦組織T2像高信號,提示局部腦組織水腫明顯,癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d時局部腦組織T2像信號明顯減低,提示腦水腫明顯減輕。FK506可顯著減輕24h時局部的腦水腫,雷帕霉素未見明顯的抑制作用。3.腦組織的水含量測定顯示癲癇組,FK506組及雷帕霉素組小鼠的腦組織含水量在癲癇發(fā)作后24h時明顯升高,7d時各組小鼠的腦組織含水量恢復到正常水平。與癲癇組小鼠相比,FK506組小鼠在24h時的腦組織含水量降低,而雷帕霉素組小鼠未顯示出明顯差異。4.通過Western blot測定癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h,72h及7d時腦組織鈣神經(jīng)素的表達。結(jié)果提示,鈣神經(jīng)素在癲癇發(fā)作后24h顯著增加,一直持續(xù)到7d。結(jié)果提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達有關(guān)。5.通過免疫組化方法檢測GFAP的表達。星形膠質(zhì)細胞胞體的GFAP是一種細胞骨架蛋白,可反映星形膠質(zhì)細胞活化的狀態(tài),是其特征性的蛋白標志,同時可以特異性的對星形膠質(zhì)細胞進行標記。結(jié)果表明,在癲癇發(fā)作后72h時GFAP表達增加,7d時更加明顯。CaN抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達,抑制星形膠質(zhì)細胞增生。雷帕霉素組在癲癇后7d時GFAP表達比癲癇組低,但比FK506組高,雷帕霉素對GFAP的抑制作用要弱于FK506。結(jié)果表明鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細胞活化中的作用,FK506可通過抑制鈣神經(jīng)素的表達,發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細胞增生的作用。結(jié)論：1.通過核磁共振掃描及腦組織含水量檢測,癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦組織出現(xiàn)明顯腦水腫,發(fā)作后7d時水腫明顯減輕。FK506可減輕癲癇后腦組織的水腫,發(fā)揮腦保護作用,雷帕霉素未見明顯的保護作用。2.癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織鈣神經(jīng)素的表達在24h顯著增加,一直持續(xù)到7d。CaN抑制劑FK506可顯著減輕24h時局部的腦水腫,雷帕霉素未見明顯的抑制作用。提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達有關(guān)。FK506對腦組織水腫的抑制作用與其抑制鈣神經(jīng)素的表達相關(guān)。3.癲癇發(fā)作后GFAP的表達增加,反映出星形膠質(zhì)細胞的活化增生,CaN抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達,抑制星形膠質(zhì)細胞增生。雷帕霉素對GFAP的抑制作用要弱于FK506。提示鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細胞活化中的作用,K506可通過抑制鈣神經(jīng)素的表達,發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細胞增生的作用。本課題應用氯化鋰—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,研究動物行為學,通過水迷宮實驗研究實驗動物的學習和空間記憶能力,通過7.0T核磁共振對實驗動物腦部掃描觀察局部腦組織水腫情況,Westblot方法觀察CaN在癲癇發(fā)作后表達的動態(tài)改變,免疫組化觀察GFAP的表達,同時觀察癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的損傷。結(jié)果提示：鈣神經(jīng)素抑制劑FK506減輕癲癇發(fā)作,改善學習和記憶能力,減輕海馬神經(jīng)元的損傷；核磁共振檢查示癲癇組局部腦組織T2像高信號,提示局部腦組織水腫明顯,鈣神經(jīng)素在癲癇發(fā)作后顯著增加,鈣神經(jīng)素抑制劑FK506可顯著減輕局部的腦水腫,雷帕霉素未見明顯的抑制作用,提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達有關(guān),FK506通過抑制鈣神經(jīng)素的表達,減輕腦組織水腫；鈣神經(jīng)素抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達,抑制星形膠質(zhì)細胞增生,雷帕霉素對GFAP的抑制作用要弱于FK506,表明鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細胞活化中的作用,K506可通過抑制鈣神經(jīng)素的表達,發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細胞增生的作用。本實驗研究提示鈣神經(jīng)素在癲癇后的認知障礙、腦組織水腫及星形膠質(zhì)細胞增生中的重要作用,FK506可通過對鈣神經(jīng)素的抑制作用,發(fā)揮抗癲癇及腦保護作用,為癲癇發(fā)病機制的進一步研究和臨床治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1

【共引文獻】

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本文編號：1503524