發(fā)布時(shí)間：2018-02-09 16:41

  本文關(guān)鍵詞： BLP TLR2 膠質(zhì)瘤 過繼免疫治療 MDSCs　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤,根據(jù)膠質(zhì)細(xì)胞的種類可分為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤等,其中星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生率占全部膠質(zhì)瘤的80%,嚴(yán)重威脅著患者的健康。臨床上治療方式主要是手術(shù)切除,輔以放療和化療,但療效非常有限,患者5年生存期低于10%。這主要的原因是膠質(zhì)瘤呈惡性浸潤性生長,手術(shù)難以完全切除；而且膠質(zhì)瘤對放、化療均不敏感；此外,腦內(nèi)還存在血腦屏障,從而極大限制了膠質(zhì)瘤治療的療效。因此,尋求新的有效的膠質(zhì)瘤治療手段就顯得尤為迫切。過繼免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域被寄予厚望。它通過從腫瘤患者體內(nèi)分離淋巴細(xì)胞,經(jīng)體外的刺激擴(kuò)增并賦予抗腫瘤特異性后,轉(zhuǎn)輸給患者以達(dá)到治療目的。目前臨床上針對急性白血病、慢性白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等多種腫瘤的治療已經(jīng)取得令人欣喜的療效。然而,目前針對膠質(zhì)瘤的過繼免疫治療尚未取得突破性進(jìn)展,這主要是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)具有特殊的生理結(jié)構(gòu)和功能。首先,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是特殊的免疫靜息區(qū)域,缺少專職抗原提呈細(xì)胞和淋巴循環(huán)系統(tǒng),腫瘤發(fā)生時(shí)不能有效激活免疫細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答；其次,膠質(zhì)瘤通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤微環(huán)境形成,介導(dǎo)免疫抑制,分泌TGF-β2等抑制分子,促進(jìn)髓樣來源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcells, Treg)聚集,同時(shí)還誘導(dǎo)抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞的形成,嚴(yán)重削弱抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此,利用綜合治療手段打破膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的免疫耐受成為膠質(zhì)瘤過繼免疫治療成功的關(guān)鍵。Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是一種重要的模式識別受體,通過識別病原相關(guān)分子模式,在抗感染、介導(dǎo)炎癥和抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近期研究顯示,TLRs激動(dòng)劑不僅參與固有免疫應(yīng)答,而且還直接介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答,在多種病理狀態(tài)下發(fā)揮相應(yīng)的功能,這其中就包括惡性腫瘤。細(xì)菌脂蛋白(bacterial lipoprotein, BLP)是細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要成分之一,是Toll樣受體2(TLR2)的激動(dòng)劑。我們的前期研究表明,BLP能有效增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答,并顯著削弱腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制。那么,BLP是否能增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療的效果呢?如果可以,其潛在的機(jī)制是什么呢?基于以上研究背景,我們以小鼠原位膠質(zhì)瘤模型為基礎(chǔ),開展了BLP聯(lián)合T細(xì)胞過繼免疫治療小鼠膠質(zhì)瘤的研究。第一部分TLR2激動(dòng)劑BLP增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療膠質(zhì)瘤療效首先,我們利用小鼠腦立體定位儀,將小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株GL261注射入尾狀核,建立了小鼠原位膠質(zhì)瘤模型,在荷瘤第5天過繼轉(zhuǎn)輸腫瘤特異性T細(xì)胞,同時(shí)于第5、7、9和11天BLP腹腔注射。我們發(fā)現(xiàn),荷瘤小鼠經(jīng)過BLP聯(lián)合T細(xì)胞過繼免疫治療后,與對照組相比生存期顯著延長,并且33%的荷瘤小鼠獲得長期存活。通過核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過BLP聯(lián)合治療后獲得長期存活的荷瘤小鼠腦部未見腫瘤生長。而且,獲得長期存活的荷瘤小鼠能夠抵抗GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的再次攻擊,證明BLP聯(lián)合治療使小鼠獲得了長期的免疫保護(hù),從而有效防止膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)。BLP是TLR2的激動(dòng)劑,那么TLR2信號通路是否參與了抗腫瘤免疫應(yīng)答呢?因此,我們利用TLR2基因敲除(TLR2-/-)小鼠重復(fù)了以上BLP聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,在TLR2基因敲除小鼠中,BLP聯(lián)合治療的療效完全缺失。因此,TLR2激動(dòng)劑BLP可顯著增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療小鼠膠質(zhì)瘤的療效,并且是通過TLR2依賴的方式實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步,我們檢測到GL261細(xì)胞株有TLR2及其共受體TLR1的表達(dá),為了解BLP是否直接影響GL261細(xì)胞的生物學(xué)表型和功能,我們使用不同濃度的BLP體外刺激GL261細(xì)胞,進(jìn)行了細(xì)胞活力、凋亡水平、細(xì)胞因子分泌等檢測。結(jié)果顯示,GL261細(xì)胞的活力和凋亡水平均未明顯改變,分泌IL-6和TNF-α的能力也未受到影響,因此BLP對GL261細(xì)胞無直接細(xì)胞毒性作用。由此我們可以得出結(jié)論,TLR2激動(dòng)劑BLP增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療小鼠膠質(zhì)瘤的療效不是通過對腫瘤細(xì)胞的直接作用實(shí)現(xiàn)的。第二部分TLR2激動(dòng)劑BLP促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)通過第一部分研究,我們證實(shí)TLR2激動(dòng)劑BLP聯(lián)合T細(xì)胞過繼免疫治療展示了良好的抗膠質(zhì)瘤效果,并且BLP不影響GL261細(xì)胞的生物學(xué)表型和功能,排除了BLP直接細(xì)胞毒性作用的可能。那么,BLP是否對過繼轉(zhuǎn)輸?shù)哪[瘤特異性T細(xì)胞體內(nèi)功能的維持和發(fā)揮有促進(jìn)作用呢?因此在本部分的研究中,我們著重探究了BLP對腫瘤特異性T細(xì)胞體內(nèi)功能的影響。首先,荷瘤小鼠經(jīng)BLP聯(lián)合T細(xì)胞過繼免疫治療后,我們分離了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),BLP聯(lián)合治療能顯著增強(qiáng)腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤,尤其是T細(xì)胞的浸潤。隨后,利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠來源的腫瘤特異性T細(xì)胞聯(lián)合BLP治療發(fā)現(xiàn),BLP聯(lián)合治療后腫瘤內(nèi)GFP+T細(xì)胞的浸潤顯著增多,腦冰凍切片的結(jié)果與之相符。進(jìn)一步分析GFP+T細(xì)胞的亞群發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞的比例為92.8%,并且具有較強(qiáng)的IFN-y分泌能力。利用real-time PCR和ELISA檢測IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),CXCL10轉(zhuǎn)錄和分泌水平的在腫瘤內(nèi)均上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步,利用CFSE標(biāo)記的腫瘤特異性T細(xì)胞過繼治療發(fā)現(xiàn),BLP聯(lián)合治療能顯著促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞體內(nèi)增殖,并維持其長期存活。此外,在GFP+腫瘤特異性T細(xì)胞聯(lián)合BLP治療的荷瘤小鼠腫瘤內(nèi)分離的GFP+T細(xì)胞,在體外具有更強(qiáng)的特異性殺傷能力。因此,基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為,TLR2激動(dòng)劑BLP促進(jìn)過繼轉(zhuǎn)輸?shù)哪[瘤特異性T細(xì)胞腦內(nèi)的浸潤和增殖、維持其體內(nèi)存活時(shí)間并增強(qiáng)其抗腫瘤免疫效應(yīng),從而有效增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞抗膠質(zhì)瘤的應(yīng)答。第三部分TLR2激動(dòng)劑BLP改善MDSCs介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制膠質(zhì)瘤通過多種免疫耐受機(jī)制促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境的形成,其中MDSCs和Treg是維持腫瘤免疫抑制的主要細(xì)胞亞群。因此我們想進(jìn)一步探究,BLP聯(lián)合治療的抗腫瘤效應(yīng)是否得益于抑制性腫瘤免疫微環(huán)境的改善。首先,我們針對這兩種抑制性細(xì)胞亞群進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,BLP聯(lián)合治療后,MDSCs在脾臟、血液中的積聚減少,在腦腫瘤局部的減少更加明顯,而Treg比例無明顯改變。CCL2是趨化MDSCs的重要趨化因子,進(jìn)一步利用real-time PCR和ELISA分析發(fā)現(xiàn),BLP聯(lián)合治療后CCL2在腫瘤局部表達(dá)水平顯著降低。利用TLR2-/-小鼠分析發(fā)現(xiàn),BLP聯(lián)合治療對MDSCs的抑制具有TLR2依賴性,而且TLR2敲除顯著降低T細(xì)胞分泌IFN-y的能力。因此我們推測,BLP通過降低CCL2的表達(dá)減少M(fèi)DSCs的腦內(nèi)浸潤,改善膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境,從而增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療膠質(zhì)瘤的療效。結(jié)論1.TLR2激動(dòng)劑BLP增強(qiáng)T細(xì)胞過繼免疫治療膠質(zhì)瘤的效果,且不依賴于BLP的直接細(xì)胞毒性作用；2.TLR2激動(dòng)劑BLP增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞的浸潤、增殖和特異性殺傷功能,促進(jìn)其發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；3.TLR2激動(dòng)劑BLP通過降低腫瘤內(nèi)CCL2表達(dá)抑制MDSCs的浸潤,改善膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境,從而促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1498387