本文關(guān)鍵詞： Ascl1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞 增殖 侵襲 細(xì)胞周期　出處：《寧夏醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:探討神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子(Achaete-scute homolog 1,Ascl1)對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87增殖和侵襲能力的影響,并初步探索其調(diào)控機(jī)制。方法:利用慢病毒載體將Ascl1基因整合到U87細(xì)胞染色體,構(gòu)建Ascl1過表達(dá)的U87細(xì)胞系穩(wěn)定株;通過觀察綠色熒光表達(dá)、Western Blot實(shí)驗(yàn)和Q-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定U87細(xì)胞中Ascl1的表達(dá)情況;CCK-8實(shí)驗(yàn)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測Ascl1對U87細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Ascl1對U87細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié);流式細(xì)胞術(shù)檢測Ascl1對U87細(xì)胞周期的調(diào)控;并通過Western Blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶4(Cyclin-dependent kinases4,CDK4)和P27的表達(dá)變化,初步揭示Ascl1調(diào)節(jié)U87細(xì)胞增殖侵襲能力的機(jī)制。結(jié)果:綠色熒光表達(dá)、Western Blot和Q-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后高表達(dá)Ascl1,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上,Ascl1基因成功整合到U87細(xì)胞染色體,構(gòu)建了Ascl1過表達(dá)的U87細(xì)胞系穩(wěn)定株;與對照組U87細(xì)胞相比,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)Ascl1的U87細(xì)胞在450nm處光密度值(OD值)下降(P0.01),BrdU摻入實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染Ascl1后U87細(xì)胞BrdU陽性細(xì)胞率降低(P0.01),提示Ascl1能降低U87細(xì)胞的增殖能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證明過表達(dá)Ascl1的U87細(xì)胞穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)減少(P0.01),提示Ascl1能降低U87細(xì)胞的侵襲性;流式細(xì)胞術(shù)表明Ascl1使U87細(xì)胞的細(xì)胞周期受阻于G0/G1期,G1期向S期轉(zhuǎn)換受到抑制(P0.01);同時(shí),Ascl1能下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc、Cyclin D1和CDK4的表達(dá),并上調(diào)P27的表達(dá)(均P0.01),表明Ascl1對U87細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。結(jié)論:Ascl1能夠降低人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖和侵襲能力,該抑制作用與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of neuroblaste-specific transfer factor Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) on the proliferation and invasion of human glioma cell line U87, and to explore its regulatory mechanism. Methods: the Ascl1 gene was integrated into the chromosome of U87 cells by lentivirus vector. A stable U87 cell line with overexpression of Ascl1 was constructed. The expression of Ascl1 in U87 cells was evaluated by observing the expression of Ascl1 in U87 cells by observing the expression of green fluorescent Blot and Q-PCR. The effect of Ascl1 on the proliferation of U87 cells was detected by CCK-8 assay and BrdU incorporation assay. The regulation of Ascl1 on the invasion ability of U87 cells was detected by transwell invasion assay. Flow cytometry was used to detect the regulation of U87 cell cycle by Ascl1, and the expression of c-myc, D1cyclin D1C, cyclin dependent kinases4CDK4) and P27 were detected by Western Blot. Results: Western Blot and Q-PCR results showed that U87 cells overexpressed ASCL 1 after transfection of lentivirus, and the transfection efficiency was more than 90% and the gene was successfully integrated into the chromosome of U87 cells. A stable U87 cell line with overexpression of Ascl1 was constructed, and the results of CCK-8 assay showed that the over-expression of Ascl1 in U87 cells decreased P0.01BrdU incorporation at 450 nm. After transfection of Ascl1, the rate of BrdU positive cells in U87 cells decreased, suggesting that Ascl1 could reduce the proliferation ability of U87 cells. Transwell invasion experiment showed that the number of U87 cells that expressed Ascl1 decreased through the basement membrane of the cell. It suggested that Ascl1 could reduce the invasiveness of U87 cells. Flow cytometry showed that Ascl1 inhibited cell cycle transition from G _ 0 / G _ 1 phase to S phase in U87 cells, and Ascl1 could down-regulate the expression of c-myc cyclin D1 and CDK4 in U87 cells. The expression of P27 was up-regulated (all P0.01a), which indicated that the inhibition of proliferation and invasion of U87 cells by Ascl1 was related to cell cycle arrest. Conclusion the cell cycle arrest is associated with the decrease of proliferation and invasion ability of human glioma cell line U87 by 1: Ascl1, which is related to the regulation of cell cycle.
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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