本文關鍵詞： 膠質母細胞瘤 膠質瘤 生物學標志物 腦脊液 腫瘤囊液 差示掃描量熱法 蛋白質組學 質譜 生物信息學分析 同位素標記相對和絕對定量 基因本體論 酶聯(lián)免疫吸附試驗 中樞神經系統(tǒng)　出處：《復旦大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：在成人中樞神經系統(tǒng)(central nervous system, CNS)各種原發(fā)性腫瘤中,以膠質瘤(glioma)最常見是,約占60%,其中惡性程度最高的膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)又占全部膠質瘤的一半以上。GBM生物學上呈現(xiàn)侵襲性生長,手術無法全切。即便予以最大安全程度切除,輔助以放、化療,腫瘤從原發(fā)灶復發(fā)幾乎無法避免,患者復發(fā)率和死亡率仍很高。膠質瘤惡性程度特異性生物學標志物,被認為有望協(xié)助神經腫瘤醫(yī)生早期、有效地診斷膠質瘤,監(jiān)測治療反應,預警復發(fā),甚至用于開發(fā)膠質瘤患者的個體化治療方案,因此是目前神經外科領域的研究熱點之一。而腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)因為其特殊的生理位置與生物學功能,一直是尋找中樞神經系統(tǒng)疾病相關生物學標志物的重要樣本來源。本課題的目的是通過比較不同惡性程度膠質瘤患者來源的CSF蛋白質組的改變,從宏觀的物理學熱穩(wěn)定特征,到微觀上的高豐度和低豐度蛋白質組成分,嘗試尋找與膠質瘤惡性程度相關的生物學標志物,為后續(xù)臨床研究和轉化奠定一定的實驗室基礎。方法：在第一部分,我們選用了39例患者來源的樣本,包括36個CSF樣本和3個GBM腫瘤囊腫液(cystfluid, CF)樣本,對其進行超濾濃縮、換鹽、蛋白定量等預處理后,采用現(xiàn)代高靈敏度的差示掃描量熱儀(differential scanning calorimeter, DSC),分析膠質瘤CSF的蛋白質組在不同疾病狀態(tài)下整體熱穩(wěn)定性的改變,并通過ELISA的方法對CSF蛋白質組的高豐度組分(10種高豐度蛋白)進行定量,初步探討熱穩(wěn)定性改變的可能機制；DSC的優(yōu)點是快速簡便,對樣本預處理要求低,但是其描述的熱力學參數(shù)僅是蛋白質組宏觀上整體的物理特征,尚缺乏微觀上,尤其是對疾病狀態(tài)下低豐度蛋白質成分改變的直接檢測能力,而以質譜技術為代表的蛋白質組技術平臺,能很好地彌補這個不足。因此在第二部分,我們首先從Pubmed檢索現(xiàn)有的基于膠質瘤CSF開展的蛋白質組研究工作,對它們進行系統(tǒng)綜述,對不同研究采用的研究方案進行總結與比較,并歸納各項研究發(fā)現(xiàn)的差異表達蛋白(潛在生物學標志物)。在此基礎上,通過應用PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)分類系統(tǒng)及IPA (Ingenuity Pathway Analysis)軟件等在線生物信息學方法,探尋不同研究發(fā)現(xiàn)之間是否存在一定的內在聯(lián)系,并基于IPA網絡尋找新的潛在膠質瘤CSF標志物,最后用ELISA的方法在我們自己收集的29例患者來源的樣本(包括26個CSF樣本和3個CF)中進行驗證；在第二部分文獻復習的基礎上,我們在第三部分研究中選用了44例患者來源的樣本(包括42個CSF樣本和2個CF),首先用ProteoMiner試劑盒去除其中的高豐度蛋白并富集低豐度蛋白,然后樣本通過過柱去鹽,Bradford法蛋白定量,酶切肽段等處理后,應用iTRAQ標記結合二維納升級反向液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜技術,鑒定并相對定量分析樣本中的蛋白成分,并依據(jù)不同篩選條件得到差異表達蛋白。對這些差異表達蛋白,首先結合生物信息學分析及文獻檢索的方法,初篩獲得目前尚未在膠質瘤研究中報道的新的蛋白分子,然后用ELISA的方法在膠質瘤患者CSF中驗證其組間差異表達的存在,最后在新收集的6例CSF中驗證用這些差異蛋白去鑒別膠質瘤惡性程度的可靠性。除此之外,我們還收集了5例GBM組織的原代細胞上清和9種惡性腫瘤細胞系上清,后者包括4種人GBM細胞系(A172, U87, U251和SHG66),2種膠質瘤細胞系(H4和SW1783)和3種非膠質瘤腫瘤細胞系(K-562, AGS和N87),用ELISA的方法對鑒定到的新蛋白進行檢測,探討這些差異蛋白可能的來源。結果：在第一部分,我們發(fā)現(xiàn)非腫瘤對照組CSF的DSC曲線,其主要轉變溫度或熔解溫度(melting temperature, Tm)是在73.20C,與之相比,良性腦腫瘤組與低級別膠質瘤(low grade glioma, LGG)組的Tm值分別升高到了73.8℃和74.1℃,而GBM組的Tm值升高最為明顯(75.6℃),統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)GBM組與其它組之間的差異存在統(tǒng)計學意義(P0.001)。進一步檢測樣本總蛋白濃度后發(fā)現(xiàn),來自GBM患者的CF樣本顯著高于其它CSF組(P0.001),而GBMCSF組也顯著高于其它CSF組(P0.05或P0.01)。在10種被檢測的高豐度蛋白中,5種蛋白(ALB, IgG, AGP, AAT和FIB)分別占CSF和CF中被檢測蛋白總含量的99%和98%以上。除了AGP外,GBM患者CF中9種蛋白的含量顯著性高于各組CSF(P0.05或P0.001)。而GBM CSF中ALB, IgG, AAT, FIB, APOA1和TRF等6種蛋白的濃度顯著性高于其它CSF組。比較這些蛋白的相對含量后發(fā)現(xiàn),CF中AAT, FIB, Cys-C和C3的相對含量較高,而在不同的CSF組間,GBM組CSF中IgG, AAT和TRF的相對含量較高,上述高豐度蛋白絕度和相對含量的改變,可能是蛋白質組總體Tm值變化的原因之一；在第二部分,根據(jù)預設的納入和排除標準,一共檢索到了8篇文獻,共計有19種蛋白被上述文獻驗證為存在于膠質瘤患者來源CSF中的差異表達蛋白。根據(jù)GO注釋與PANTHER分析,絕大部分這些差異表達蛋白的分子功能是“結合”,亞細胞定位為“細胞外區(qū)域”；值得注意的是,它們參與的生物學過程為“炎癥反應”,“應激／缺氧應答”和“凋亡過程”等,提示它們可能參與了膠質瘤惡性進展和宿主抗腫瘤免疫應答等過程。根據(jù)HPA數(shù)據(jù)庫,絕大部分這些蛋白在膠質瘤組織中的表達量與正常CNS組織相比是升高的。在這19種蛋白中,只有一種蛋白(attractin)被不同的文獻重復鑒定到,而這可能是由于不同研究在具體采用的實驗方案上存在差異所造成。IPA分析顯示,這19種蛋白具有包括“炎癥反應”、“癌癥”、“細胞死亡和生存”在內的重要功能,參與了包括“急性期反應信號通路”、"VEGF信號通路”,“p38信號通路”等重要的通路,構建的第一個網絡圖的核心蛋白分子主要位于細胞核內(如MAPK3/MAPK1, HNRNPA2B1與CEBPA),具有DNA結合,催化活性和轉錄調節(jié)活性等生物學功能,而第二個網絡圖顯示IL-6/STAT-3信號通路處于核心地位。據(jù)此,我們挑選了GAL, HSPA5, WNT和IL-6等4個節(jié)點蛋白,在本課題收集的CSF與CF中進行了驗證,結果表明,GAL, HSPA5與WNT三個蛋白的含量在CF中顯著性低于CSF,但是在不同CSF組間不存在統(tǒng)計學差異；而IL-6不僅在GBMCF中的濃度顯著高于其他CSF組(P0.001),而且在GBM CSF中的濃度顯著性高于其他惡性度較低膠質瘤組的CSF(P0.001),提示IL-6具有成為GBM生物學標志物的潛力；在第三部分,我們在經過低豐度蛋白富集后的CSF中總共鑒定得到445種蛋白成分。根據(jù)GO注釋,它們的細胞定位主要集中于細胞外(24%)、細胞膜(13%)、細胞質(11%)、其它細胞內的細胞器(11%)等,參與的生物學過程主要是調節(jié)(22%)、細胞過程(18%)、代謝過程(9%)、對刺激反應(9%)等,具有的分子功能主要是結合(48%)、催化活性(22%)、蛋白酶調節(jié)活性(10%)等。在這445種蛋白中,144種蛋白的表達與星形細胞瘤惡性程度相關(WHO Ⅱ級→Ⅳ級：逐級上調84個,逐級下調60個),14種蛋白與膠質瘤瘤惡性程度相關(WHO Ⅰ級→Ⅳ級：逐級上調5個,逐級下調9個),17種蛋白在高級別膠質瘤(HGG)和LGG組間有顯著性差異表達(上調3個,下調14個,P0.05),179種蛋白在原發(fā)和復發(fā)GBM組間有差異(上調超過2倍89個,下調超過2倍90個),135種蛋白在高級別少突膠質瘤和低級別少突膠質瘤之間有差異(上調超過2倍53個,下調超過2倍82個)。IPA分析顯示,由這些差異蛋白構建的分子信號網絡中,涉及的Top Functions主要有蛋白合成,脂質代謝和小分子生化,碳水化合物代謝,細胞間信號傳導,免疫細胞遷移,體液性免疫應答,炎癥反應,DNA復制、重組和修復,癌癥,細胞運動,分子轉運,細胞死亡和生存,細胞周期等。通過ELISA驗證后,6種蛋白的含量被證實在GBM組CSF中的含量顯著性高于其它惡性較低膠質瘤CSF組,它們分別是vinculin (VCL)蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶A4(protein disulfide isomerase family A, member 4, PDIA4)、靜止素Q6巰基氧化酶1 (quiescin Q6 sulfhydryl oxidase 1, QSOXl)、肌肽二肽酶(carnosine dipeptidase 1, CNDP1)、血小板因子4 (platelet factor 4, PF4)和分泌型卷曲相關蛋白3(secreted frizzled-related protein, SFRP3) 。比較上述蛋白在GBM組織原代細胞培養(yǎng)上清和CSF中的含量后發(fā)現(xiàn),SFRP3和VCL,尤其是后者在細胞上清中的含量顯著高于CSF,提示它們可能來源于腫瘤分泌。比較膠質瘤細胞系與非膠質瘤細胞系培養(yǎng)上清后發(fā)現(xiàn),QSOX1、SFRP3和VCL在膠質瘤細胞系上清中的含量較高,提示它們的分泌可能具有膠質瘤特異性,尤其是QSOX1,其濃度在H4、SW1783和U87這三種惡性度逐級上升的細胞系上清中也呈現(xiàn)逐級升高的趨勢,提示可能與膠質瘤惡性程度具有較好的相關性。上述蛋白在膠質瘤患者CSF和細胞上清中的差異表達,尚未見文獻報道。結論：我們首次發(fā)現(xiàn),基于CSF蛋白質組的熱穩(wěn)定性,快捷簡便的DSC檢測具有提示膠質瘤惡性程度的能力,而疾病狀態(tài)下多種高豐度蛋白質成分的改變可能是Tm值改變的原因之一；由于DSC反映的是蛋白質組整體(特別是高豐度組分)的特征,因此利用高通量、高分辨率的蛋白質組質譜平臺檢測疾病狀態(tài)相關的低豐度蛋白的改變,不失為DSC技術的有力互補。我們進而首次對現(xiàn)有的膠質瘤CSF質譜研究進行了系統(tǒng)綜述,不僅總結了已報道的潛在生物學標志物,而且還驗證了通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)的新的標志物(如IL-6)；我們最后還首次通過iTRAQ定量標記質譜技術對膠質瘤CSF蛋白質組進行了檢測,發(fā)現(xiàn)了CNDP1、 PDIA4、QSOX1、PF4、SFRP3和VCL等在GBM與其它惡性度較低膠質瘤之間存在差異表達的蛋白分子,而上述發(fā)現(xiàn)均未見文獻報道。這些膠質瘤相關的低豐度差異蛋白,其來源可能是腫瘤組織、腫瘤微環(huán)境或是機體反應性表達、分泌或釋放進入CSF,不僅有望成為GBM患者CSF中的生物學標志物,而且也值得進一步研究闡明其起到的生物學功能。當然,質譜技術也有著昂貴、耗時費力等不足,因此可以充分利用DSC技術快捷簡便的優(yōu)點予以互補,本課題因此也為今后對這兩種技術開展大規(guī)模樣本驗證以及臨床應用奠定了一定的實驗室研究基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

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