本文關(guān)鍵詞： 細(xì)胞壞死 TNF-α 海馬神經(jīng)元 RIP3 ROS 鈣離子通道 神經(jīng)毒性　出處：《蘇州大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【研究背景和意義】腫瘤壞死因子(TNF-)在調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥方面是一個(gè)重要的促炎癥因子。在各種神經(jīng)退行性疾病中，例如阿爾茨海默�。蠢夏臧V呆癥）和帕金森氏病中可以看到TNF-的上調(diào)。然而，TNF-誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性這條信號(hào)通路仍然不清楚。 【研究目的】確定RIP3介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死（又稱necroptosis）是否參與TNF-和TRAIL誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性。 【研究方法】野生型小鼠和RIP3缺陷型小鼠分別注射PBS和不同濃度腫瘤壞死因子（TNF-）,通過(guò)小鼠大腦組織切片染色觀察小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞損傷情況以及檢測(cè)TNF-刺激后海馬組織中細(xì)胞壞死關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達(dá)情況；利用普遍用于研究的海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT-22深入研究TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制,首先檢測(cè)HT-22細(xì)胞對(duì)TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（常規(guī)誘導(dǎo)體系為TNF-或者TNF-Smac mimetic）和TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死(常規(guī)誘導(dǎo)體系為TNF-/z-VAD）的敏感性，同時(shí)也檢測(cè)了細(xì)胞對(duì)TNF家族的另一重要因子TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死的敏感性；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)分別沉默程序性細(xì)胞壞死通路中的相關(guān)蛋白，檢測(cè)蛋白沉默后對(duì)TNF-/z-VAD或TRAIL/z-VAD誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響；應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)沉默后關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況；應(yīng)用慢病毒感染的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)野生型RIP3(WT)，激酶突變的RIP3(RIP3-K51A)和RIP同源相互作用域突變的RIP3(RIP3-RHIM Mut)的HT-22的細(xì)胞系檢測(cè)關(guān)鍵蛋白R(shí)IP3在TNF-/z-VAD或TRAIL/z-VAD誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死中的作用；利用特異性化學(xué)抑制劑分別干預(yù)ROS以及鈣離子通道，從而檢測(cè)這些步驟是否參與TNF-誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞壞死。 【研究結(jié)果】（1）小鼠腦室內(nèi)注射TNF-后，發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠海馬區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)損傷，而且呈現(xiàn)劑量依賴性，但在RIP3缺陷的小鼠中并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的海馬細(xì)胞損傷；應(yīng)用蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)注射TNF-的野生型小鼠海馬組織中RIP3和RIP1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明RIP3-依賴性細(xì)胞壞死參與TNF-誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性。（2）我們選擇了小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT-22用于深入研究TNF-誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)毒性的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)HT-22細(xì)胞對(duì)常規(guī)的TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡體系不敏感，只有在凋亡抑制劑z-VAD的存在下才對(duì)TNF-表現(xiàn)出敏感性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)只在z-VAD的存在下細(xì)胞對(duì)TRAIL也表現(xiàn)出敏感性下提示這些表明HT-22細(xì)胞更傾向于發(fā)生TNF-以及TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死而不是凋亡。（3）通過(guò)RNAi干擾技術(shù)，沉默RIP3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RIP3的缺陷能抑制TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡，這說(shuō)明TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是RIP3介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死。（4）進(jìn)一步沉默RIP1或者CYLD（RIP1的去泛素化酶）,同樣能夠抑制這種細(xì)胞死亡，也說(shuō)明這種細(xì)胞壞死依賴于RIP1和CYLD。（5）接著我們又沉默了RIP3下游蛋白MLKL,該蛋白也是TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。以上結(jié)果說(shuō)明了TNF-誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞壞死是由CYLD-RIP1-RIP3-MLKL信號(hào)通路所介導(dǎo)發(fā)生的。（6）ROS以及鈣離子通道被報(bào)道在一些細(xì)胞株中參與TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，我們利用了兩種ROS抑制劑（BHA和NAC）以及鈣離子抑制劑（LaCl3）干預(yù)這些步驟，，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑并不能有效阻止TNF-誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞壞死，表明TNF-誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死不依賴于ROS以及鈣離子通道。 【結(jié)論】綜上所述，這些結(jié)果不僅首次提供了RIP3在體內(nèi)參與TNF-誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性的證據(jù)，并且揭示了TNF-可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生CYLD-RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的細(xì)胞壞死，而且其下游信號(hào)不依賴于ROS和鈣離子通道。
[Abstract]:[tumor] research background and significance of necrosis factor (TNF-) in the regulation of nerve inflammation is an important proinflammatory factor. In a variety of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (Alzheimer's) and Parkinson's disease can be seen in the up regulation of TNF-. However, TNF- neurotoxicity induced by this pathway is still not clear.
[Objective] to determine whether RIP3 mediated programmed cell necrosis (also called necroptosis) is involved in the neurotoxicity induced by TNF- and TRAIL.
[Methods] wild type mice and RIP3 deficient mice were injected with different concentrations of PBS and tumor necrosis factor (TNF-), the expression of cell necrosis in hippocampus of mice hippocampus and brain cell injury after TNF- stimulation in the detection of key regulatory proteins in mouse brain slices stained by using; commonly used in the hippocampal neuronal cell line HT-22 study of TNF- induced cell death mechanism research, the first detection of HT-22 cells to TNF- induced apoptosis (conventional induction system for TNF- or TNF-Smac mimetic) and TNF- induced cell necrosis (conventional induction system TNF-/z-VAD) sensitivity, but also examined the sensitivity of cells to TNF family is another important factor induced by TRAIL the cell apoptosis and necrosis were silenced by RNA interference; related protein programmed cell death pathway, detection of eggs Effect of induction of TNF-/z-VAD or TRAIL/z-VAD white silence neurotoxicity; expression of proteins used by Western blotting after silencing the key protein; build a stable method using lentivirus infection expression of wild type RIP3 (WT), RIP3 kinase (RIP3-K51A) mutation and RIP homologous interaction domain mutations in RIP3 (RIP3-RHIM Mut RIP3) the key protein in HT-22 cell line detection in TNF-/z-VAD or TRAIL/z-VAD induced cell necrosis in action; using specific chemical inhibitors were the intervention of ROS and calcium ion channel, so as to detect these steps are involved in HT-22 cell necrosis induced by TNF-.
[results] (1) the mouse brain after injection of TNF-, found in the injury of hippocampus neurons in wild-type mice, and showed dose dependent, but there were no obvious damage of hippocampal cells in RIP3 deficient mice; Western blot using protein found significantly increased the expression of RIP3 protein and RIP1 injection of TNF- wild type of mouse hippocampus. These results suggest that RIP3- dependent cell necrosis in TNF- induced neurotoxicity in mouse hippocampus. (2) we chose the nerve cells in hippocampus of HT-22 mice for further study of molecular mechanism of TNF- induced hippocampal neurotoxicity. We found no sensitive system on the apoptosis of HT-22 cells induced by conventional TNF-, only in the the presence of apoptosis inhibitor z-VAD on TNF- showed sensitivity, also found only in the presence of z-VAD cells to TRAIL also showed the sensitivity that These indicate that HT-22 cells are more prone to TNF- and TRAIL induced cell necrosis but not apoptosis. (3) by RNAi interference technology to silence the expression of RIP3 protein, found in hippocampal neurons of RIP3 defects can inhibit TNF-/z-VAD and TRAIL/z-VAD induced cell death, indicating that TNF-/ z-VAD and TRAIL/z-VAD induced cell death is programmed cell necrosis RIP3 mediated silencing of RIP1. (4) further or CYLD (deubiquitinating enzyme RIP1), can also inhibit the cell death, also shows that the cell necrosis depends on RIP1 and CYLD. (5) then we silenced the RIP3 downstream protein MLKL, the protein is TNF-/z-VAD and TRAIL/z-VAD induced cell death. Results show that the hippocampus cell necrosis induced by TNF- is mediated by CYLD-RIP1-RIP3-MLKL signaling pathway occurs. (6) ROS and calcium ion channels are reported to participate in the TNF- in some cell lines Alpha induced cell necrosis, we use two kinds of ROS inhibitors (BHA and NAC) and calcium ion inhibitor (LaCl3) intervention in these steps, found that HT-22 cell necrosis and can not effectively prevent these inhibitors induced by TNF-, suggesting that TNF- induced hippocampal neuronal necrosis does not depend on the ROS and calcium ion channel.
[Conclusion] in conclusion, these results not only provide the first in vivo toxicity in RIP3 TNF- induced hippocampal neural cells and evidence reveals that TNF- could induce CYLD-RIP1-RIP3-MLKL mediated cell death of hippocampal neural cells and its downstream signal does not depend on ROS and calcium channels.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：1483183