本文關(guān)鍵詞： 腦缺血 炎癥 肉桂醛 神經(jīng)保護 TLR4 TRAF6 NF-κB　出處：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型,在世界范圍內(nèi),是成人死亡的第三大原因,致殘的首位原因。其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復發(fā)率、恢復緩慢的特點,給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前,靜脈溶栓被認為是唯一有效而可行的卒中治療措施,但是由于其嚴格的治療時間窗以及顱內(nèi)出血的風險,從此項治療中獲益的患者十分有限。因此,為腦卒中治療尋找新的方案就顯得尤為重要。缺血后繼發(fā)性腦損傷是患者的病情加重和影響預后的重要原因,導致繼發(fā)性腦損傷的病理機制主要包括炎癥反應、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、凋亡等,這幾種因素之間相互作用,構(gòu)成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,從而形成惡性循環(huán),導致一系列病理級聯(lián)反應,其中過度炎癥反應存在于腦缺血后的壞死和缺血區(qū)域,是加重繼發(fā)性腦損傷的主要原因之一,因此抗炎癥損傷成為治療缺血性腦血管病的重要途徑之一。Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)/核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路在促進炎癥反應中發(fā)揮重要作用,激活TLRs能夠誘導下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,并誘導炎癥相關(guān)分子和細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。也有大量研究證實,TLRs和NF-κB是腦缺血后繼發(fā)炎癥損傷中的關(guān)鍵分子。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumour-necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6),作為TLRs介導信號通路下游的重要配體分子,介導了下游NF-κB的激活。因此,TLRs和下游的信號分子是缺血性腦血管病抗炎治療的關(guān)鍵靶點。肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)是樟科植物肉桂的干皮及樹皮經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油(肉桂油)中的主要成分,研究表明CA具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗凋亡、抗病毒、抗細菌、抗突變等多種生物學作用,并且毒副作用低,已經(jīng)作為食用香料被廣泛而安全的應用于飲料,冰激凌,糖果,口香糖等食品中,具有良好的臨床應用潛力。在離體細胞研究中發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠抑制脂多糖誘導的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)受體及下游TRAF6及NF-κB的表達增高,而最近在大鼠心肌缺血再灌注模型中也發(fā)現(xiàn)肉桂醛抑制TLR4內(nèi)源性配體人高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的表達,從而保護缺血受損心肌細胞。本研究選用雄性CD-1小鼠為研究對象,應用改良Longa線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)模型。在小鼠永久性大腦中動脈閉塞所致的局灶性腦缺血模型中應用肉桂醛進行干預,通過對腦梗死體積、腦組織含水量及神經(jīng)功能缺損評估,觀察肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用;通過對腦組織炎癥介質(zhì)釋放,中性粒細胞浸潤程度測定,觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎癥損傷作用;通過對TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子表達的測定,觀察肉桂醛對TLR4/TRAF6/NF-κB促炎信號通路的影響,探討局灶性腦缺血后肉桂醛抗炎及腦保護作用可能的機制。本研究分為三部分,現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。第一部分肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用目的:觀察小鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量、腦梗死體積。研究肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用。方法:選用成年雄性CD-1小鼠、采用改良線栓法制備大腦中動脈閉塞模型。在大腦中動脈閉塞的24 h和72 h后,通過Bederson法評價神經(jīng)功能缺損,干濕重法測定腦組織含水量,2%2,3,5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法測定腦梗死體積,觀察肉桂醛的神經(jīng)保護作用。隨機將CD-1小鼠分為7組:假手術(shù)組(Sham+生理鹽水,Sham+0.2%DMSO):小鼠假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水或者0.2%DMSO;大腦中動脈閉塞組(MCAO+生理鹽水,MCAO+0.2%DMSO):小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射等量生理鹽水或者0.2%DMSO;肉桂醛低劑量組(CA25組):小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛25 mg/kg;肉桂醛中劑量組(CA50組):小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;肉桂醛高劑量組(CA75組):小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛75mg/kg。通過預實驗,我們在假手術(shù)組和大腦中動脈閉塞組中發(fā)現(xiàn)小鼠給予等量生理鹽水或者0.2%DMSO,兩者神經(jīng)功能缺損評分,腦組織含水量,腦梗死體積測定是沒有統(tǒng)計學差異的,因此,我們除外了溶劑,即0.2%DMSO的生物學效應。最終共有5組:Sham組(小鼠假手術(shù)后腹腔注射0.2%DMSO),MCAO組(小鼠大腦中動脈閉塞后腹腔注射0.2%DMSO),CA25組,CA50組和CA75組被納入接下來的試驗。為了更進一步評價肉桂醛的腦保護作用,我們觀察了肉桂醛不同時間點給藥對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用。分別在缺血前1 h,缺血后即刻、4 h及8 h,腹腔注射肉桂醛50 mg/kg,在缺血后24 h觀察小鼠的神經(jīng)功能缺損評分,腦梗死體積,從而評價肉桂醛于不同時間點給藥對腦缺血小鼠的腦保護作用。結(jié)果1 Sham組無神經(jīng)功能缺損,神經(jīng)功能缺損評分為0分;MCAO組在24 h和72 h神經(jīng)功能缺損評分均較嚴重;CA25組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評分沒有明顯降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),CA50組和CA75組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評分明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2 CA25組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均沒有明顯降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),CA50組和CA75組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3 CA25組的腦梗死體積在24 h和72 h與MCAO組相比均沒有顯著降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),CA50和CA75組的腦梗死體積在24 h和72 h分別與MCAO組相比均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。據(jù)此,我們從神經(jīng)功能缺損評分,腦水腫,腦梗死體積三方面觀察,發(fā)現(xiàn)肉桂醛以高劑量(75 mg/kg)和中劑量(50mg/kg)給藥時可以發(fā)揮較好的治療效果,因此,后續(xù)的研究主要集中在肉桂醛的中劑量(50 mg/kg)。4于缺血前1小時,缺血后后即刻和4小時腹腔給予肉桂醛(50mg/kg),神經(jīng)功能缺損評分和梗死體積較MCAO組明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而在缺血后8小時給予肉桂醛,神經(jīng)功能缺損評分和梗死體積和MCAO組相比無明顯降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:缺血后即刻腹腔注射肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠具有腦保護作用,能夠改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺損,減輕腦組織含水量并減小腦梗死體積。不僅如此,肉桂醛于缺血前1小時,缺血后4小時給藥仍然具有腦保護作用。第二部分肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用目的:通過對腦組織炎癥介質(zhì)釋放,中性粒細胞浸潤程度測定,觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎癥損傷作用。方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象,采用改良Longa線栓法制備大腦中動脈閉塞模型。隨機將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組(Sham組),假手術(shù)后腹腔注射0.2%DMSO;大腦中動脈閉塞組(MCAO組),小鼠大腦中動脈閉塞后腹腔注射等量0.2%DMSO;肉桂醛中劑量組(CA50組),小鼠大腦中動脈閉塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進行神經(jīng)功能缺損評分,分別于缺血后24 h和72 h,應用免疫組化,Western-blot,MPO活性試劑盒及q RT-PCR方法檢測缺血腦組織中MPO表達、MPO活性和炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果:缺血后24 h和72 h,MPO的表達及活性均有升高,肉桂醛(50mg/kg)干預后MPO表達水平及活性下降。1通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn),與MCAO組相比,CA50組的MPO陽性細胞表達在24 h和72 h均有顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2通過Western-blot發(fā)現(xiàn),與MCAO組相比,CA50組MPO蛋白表達水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3與免疫組化染色和Western-blot的結(jié)果一致,CA50組的MPO活性在24 h和72 h和MCAO組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4通過q RT-PCR發(fā)現(xiàn),炎癥介質(zhì)(TNF-α,IL-1β,MCP-1,ELAM-1)在局灶性腦缺后24 h顯著升高,肉桂醛(50 mg/kg)于局灶性腦缺血后24 h能夠顯著降低上述炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在局灶性缺血72 h后,和MCAO組相比,CA50組TNF-α和MCP-1 m RNA水平明顯減低(P0.05),然而,IL-1β和ELAM-1 m RNA水平?jīng)]有明顯變化(P0.05)。結(jié)論:局灶性腦缺血后24 h和72 h,缺血腦組織的炎癥介質(zhì)(炎性因子,趨化因子及粘附因子)的轉(zhuǎn)錄水平及MPO表達、活性均顯著升高,而肉桂醛能夠明顯減低缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放、MPO表達及MPO活性,提示肉桂醛能夠抑制缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放及中性粒細胞的浸潤。而肉桂醛抑制炎癥介質(zhì)釋放及中性粒細胞浸潤和對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用是一致的,故我們推測肉桂醛可能通過抗炎癥損傷發(fā)揮其腦保護作用。第三部分肉桂醛對局灶性腦缺血后TLR4/TRAF6/NF-κB通路影響目的:觀察腦缺血損傷后不同時間點TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子的表達變化,研究肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠抗炎及神經(jīng)保護作用的可能信號轉(zhuǎn)導機制。方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象,應用改良Longa線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞模型(MCAO)。隨機將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組(Sham組),假手術(shù)后腹腔注射0.2%DMSO;大腦中動脈阻塞組(MCAO組),小鼠大腦中動脈阻塞后腹腔注射等量0.2%DMSO;肉桂醛中劑量組(CA50組),小鼠大腦中動脈阻塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進行神經(jīng)功能評分,分別用免疫組化,Western-blot和q RT-PCR的方法檢測不同時間點缺血腦組織中TLR4,TRAF6及NF-κB蛋白表達和m RNA水平的變化。結(jié)果:缺血后24 h和72 h,TLR4、TRAF6及NF-κB的表達均有升高,而肉桂醛(50 mg/kg)降低局灶性腦缺血小鼠腦組織中TLR4、TRAF6及NF-κB表達。1通過免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn),與MCAO組相比,CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB陽性細胞數(shù)在24 h和72 h均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2通過Western-blot分析發(fā)現(xiàn),CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB蛋白表達水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3與免疫組化染色分析和Western-blot的結(jié)果一致,CA50組m RNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:局灶性腦缺血后,肉桂醛對缺血腦組織中的TLR4、TRAF6、NF-κB表達的抑制與肉桂醛腦保護作用及抗炎癥損傷程度一致,提示肉桂醛有可能通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB炎癥通路,從而減輕缺血腦組織的過度炎癥反應實現(xiàn)缺血后的腦保護作用。
[Abstract]:Because of its high morbidity , high mortality rate , high disability rate , high recurrence rate and slow recovery , it is very important to find a new scheme for the treatment of ischemic cerebrovascular disease . The effects of cinnamic aldehyde on the brain protection of rats with focal cerebral ischemia were studied by using modified Longa method to evaluate the effects of cinnamic aldehyde on the brain protection of rats with focal cerebral ischemia . The protective effects of cinnamic aldehyde at different time points on brain protection of rats with focal cerebral ischemia were studied . The results showed that the rats were injected intraperitoneally with 0 . 2 % DMSO at 24 h after ischemia , and the rats were injected with 0 . 2 % DMSO immediately after occlusion of the middle cerebral artery . The cerebral infarction volume of CA50 and CA75 groups was significantly lower than that in the middle dose ( 50 mg / kg ) . The results showed that the cerebral infarction volume of CA50 and CA75 groups was significantly lower than that in the middle dose group ( P0.05 ) . The levels of MPO and MPO in CA50 group were significantly lower than those in the middle cerebral ischemia group ( P0.05 ) . The levels of MPO and MPO in CA50 group were significantly lower than those in the middle cerebral ischemia group ( P0.05 ) . The effects of cinnamic aldehyde on anti - inflammatory and NF - 魏B in brain tissue of mice were studied by immunohistochemistry , Western - blot and q - RT - PCR . The inhibition of TRAF6 and NF - 魏B expression is consistent with the protective effect of cinnamyl aldehyde and the degree of anti - inflammatory injury . It is suggested that cinnamic aldehyde may inhibit the inflammatory pathway of IL - 4 / TRAF6 / NF - 魏B , thus reducing the excessive inflammatory response of ischemic brain tissue to protect the cerebral protective effect after ischemia .

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.31

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本文編號：1469142