本文關(guān)鍵詞： 雪旺細(xì)胞 面神經(jīng)損傷 神經(jīng)水腫 水通道蛋白1 滲透水通透系數(shù)　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[研究背景] 面癱按其發(fā)生的部位可分為中樞性和周圍性兩大類,而面神經(jīng)獨(dú)特的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)則是造成周圍型面癱發(fā)病率高且難于治療的重要原因。面神經(jīng)從腦內(nèi)發(fā)出后即進(jìn)入內(nèi)聽(tīng)道,走形于一個(gè)狹小的骨性管道內(nèi)。在受到損傷因素刺激后,面神經(jīng)發(fā)生炎癥反應(yīng),出現(xiàn)水腫。但由于骨性管道的束縛,面神經(jīng)發(fā)生炎癥水腫后缺乏腫脹的空間,使面神經(jīng)管內(nèi)壓力增高,進(jìn)一步影響局部血運(yùn),加重神經(jīng)損傷,形成“水腫—缺血—水腫”的惡性循環(huán)。在面癱的發(fā)病過(guò)程中,水腫起著重要的作用,如何減輕面神經(jīng)的水腫則成為面癱治療中的關(guān)鍵點(diǎn)。水通道蛋白(AQPs)是一類可以快速轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜通道蛋白,在全身多個(gè)組織、器官上參與細(xì)胞膜內(nèi)外的水代謝和水腫的形成。外周神經(jīng)主要表達(dá)水通道蛋白1,即AQP1。本課題組的前期研究證實(shí)AQP1表達(dá)于小鼠面神經(jīng)雪旺細(xì)胞的胞膜上,隨后,在小鼠面神經(jīng)離斷傷模型上發(fā)現(xiàn),面神經(jīng)受損水腫后,AQP1的表達(dá)明顯升高,且與水腫程度在時(shí)相上有一定的相關(guān)性,提示其可能參與細(xì)胞水腫的形成。在目前文獻(xiàn)中,尚未發(fā)現(xiàn)可明確調(diào)節(jié)AQP1表達(dá)及功能的藥物。乙酰唑胺(AZA)作為一種可能的AQP1抑制劑多有報(bào)道,但其具體作用尚存在一定爭(zhēng)議。因此,本研究旨在明確乙酰唑胺對(duì)面神經(jīng)雪旺細(xì)胞AQP1功能及表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,并在小鼠面神經(jīng)離斷傷模型上探索乙酰唑胺對(duì)面神經(jīng)水腫及AQP1表達(dá)的影響,以期為臨床治療面神經(jīng)水腫提供一定的理論依據(jù)。 [研究目的] 1、在細(xì)胞水平探究乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞AQP1的表達(dá)調(diào)節(jié)作用； 2、通過(guò)滲透壓力實(shí)驗(yàn)探究乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞AQP1的功能調(diào)節(jié)作用； 3、構(gòu)建小鼠面神經(jīng)離斷模型,探究乙酰唑胺在面神經(jīng)受損后對(duì)面神經(jīng)AQP1表達(dá)及面神經(jīng)水腫的影響,以期為臨床上治療面神經(jīng)水腫提供新的思路。 [研究方法] 1、原代培養(yǎng)小鼠面神經(jīng)雪旺細(xì)胞,確認(rèn)其是否表達(dá)AQP1。 (1)選取新生5天的Balb/e小鼠,切取其雙側(cè)面神經(jīng),采用胰酶消化,差速貼壁法提純后進(jìn)行原代培養(yǎng)。 (2)用AQP1和S-100免疫熒光共標(biāo)染色的方法鑒定培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,并驗(yàn)證其APQ1的表達(dá)。 2、用MTT法檢測(cè)乙酰唑胺對(duì)原代培養(yǎng)面神經(jīng)雪旺細(xì)胞增殖作用的影響。 3、行滲透壓力試驗(yàn)測(cè)量雪旺細(xì)胞的水滲透系數(shù)(water permeability, Pf值),觀察乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞AQP1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞共分為3組。A組,原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,未加干預(yù)藥物；B組,滲透壓力測(cè)量前30min,加入10μM終濃度的乙酰唑胺；C組,滲透壓力測(cè)量前30min,加入10μM終濃度的HgCl2。細(xì)胞在加入calcein-AM37℃避光孵育30min后,熒光劑進(jìn)入活細(xì)胞。此時(shí)將細(xì)胞膜外的液體環(huán)境突然變?yōu)榈蜐B,細(xì)胞外水分子進(jìn)入細(xì)胞,熒光劑被稀釋,利用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化,并計(jì)算細(xì)胞對(duì)水分子的通透性,即Pf值。而Pf值直接反映出乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞AQP1功能的調(diào)節(jié)作用。 4、在雪旺細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0.1μM、1μM、10μM終濃度的乙酰唑胺,培養(yǎng)3天后進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè),觀察雪旺細(xì)胞AQP1分別在基因和蛋白水平上的表達(dá)變化情況,明確乙酰唑胺對(duì)AQP1表達(dá)的表達(dá)影響。 5、選取5周齡,20-22g健康的Balb/c小鼠,構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型,觀察面神經(jīng)在面神經(jīng)管內(nèi)的走形,以及在給予乙酰唑胺干預(yù)后面神經(jīng)水腫情況和AQP1的表達(dá)情況。 (1)采取耳下切口,在耳廓軟骨前完全離斷面神經(jīng),構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型,實(shí)驗(yàn)組通過(guò)灌胃給予乙酰唑胺(40mg/Kg-d),對(duì)照組給予生理鹽水(40mg/Kg-d)分別在面神經(jīng)離斷后1d、3d、5d、7d處死動(dòng)物,切取面神經(jīng)顱骨段,切取標(biāo)本后行RT-PCR和Western Blot檢測(cè),觀察藥物對(duì)面神經(jīng)AQP1的表達(dá)的影響。 (2)同法構(gòu)建小鼠面神經(jīng)離斷模型,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理同上,分別在面神經(jīng)離斷后1d、3d、5d、7d后切取頭顱標(biāo)本,行4%多聚甲醛固定、10%中性EDTA浸泡脫鈣、20%與30%蔗糖階梯脫水后,進(jìn)行冰凍切片,觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中不同時(shí)間點(diǎn)面神經(jīng)的水腫情況。 [結(jié)果] 1、在Balb/c小鼠的面神經(jīng)原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞上行AQP1和S-100免疫熒光共標(biāo)染色后,熒光顯微鏡下可見(jiàn)二者均顯色,存在于同一細(xì)胞中,證實(shí)雪旺細(xì)胞上明確表達(dá)AQP1。 2、乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞的增殖活力無(wú)明顯影響。 3、雪旺細(xì)胞滲透水通透性(Pf值)的測(cè)量結(jié)果顯示,A組(對(duì)照組)灌流曲線呈典型的“Z”形,Pf值最大,對(duì)水的通透性最好；B組(10μM終濃度的乙酰唑胺孵育30min)灌流曲線仍呈典型的“z”形,細(xì)胞的Pf值較A組小。C組(10μM終濃度的HgCl2孵育30min)未見(jiàn)典型的“Z”灌流曲線,其Pf值明顯較A組、B組為小,即Pf值：A組B組C組。 4、在原代細(xì)胞培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞內(nèi)加入不同濃度乙酰唑胺共培養(yǎng)后,進(jìn)行western和RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示在終濃度為0.1μM時(shí),乙酰唑胺即能明顯降低雪旺細(xì)胞AQP1基因及蛋白的表達(dá),且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)并無(wú)明顯濃度依賴性的作用。 5、對(duì)構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型的小鼠,每日灌胃給予乙酰唑胺(實(shí)驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組),分別于離斷傷后第1、3、5、7天取材行Western Blot和RT-PCR檢測(cè)。Western Blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組AQP1的表達(dá)在傷后3天低于對(duì)照組,在傷后7天高于對(duì)照組,傷后1、5天無(wú)明顯區(qū)別。RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組AQP1的表達(dá)在傷后1、3天低于對(duì)照組,在傷后5、7天高于對(duì)照組。 6、小鼠面神經(jīng)在顱骨內(nèi)走形：面神經(jīng)自腦內(nèi)穿出進(jìn)入顱骨面神經(jīng)管內(nèi),在距離顱骨入口及出口處不遠(yuǎn)轉(zhuǎn)彎,形成“S”形。面神經(jīng)走行在耳蝸段時(shí)與蝸水管靜脈伴行,此處面神經(jīng)管骨質(zhì)不連續(xù),繼續(xù)向外至迷路段面神經(jīng)管再次移行為完整的骨性管道包繞面神經(jīng)。 7、面神經(jīng)離斷后給予乙酰唑胺對(duì)神經(jīng)水腫的影響：通過(guò)對(duì)面神經(jīng)顳骨段冰凍切片的觀察及測(cè)量,面神經(jīng)在離斷后第1天即出現(xiàn)明顯的腫脹,第3天時(shí)達(dá)到高峰。小鼠面神經(jīng)在離斷后第3天,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組神經(jīng)腫脹程度較輕,但在離斷后第1、5、7天時(shí),面神經(jīng)腫脹程度與是否給藥無(wú)明顯區(qū)別。 [結(jié)論] 1、在小鼠來(lái)源的原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞上,乙酰唑胺可明顯抑制AQP1的表達(dá)。 2、乙酰唑胺對(duì)雪旺細(xì)胞增殖無(wú)明顯的抑制作用。 3、在小鼠面神經(jīng)來(lái)源的原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞上,乙酰唑胺可抑制AQP1的表達(dá)和功能。 4、在面神經(jīng)離斷傷模型上,乙酰唑胺可降低小鼠的AQP1表達(dá)的峰值(傷后第3天),并降低面神經(jīng)水腫峰值的程度(傷后第3天),但在恢復(fù)期乙酰唑胺對(duì)水腫的影響不明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R745.12

【參考文獻(xiàn)】

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1 母生梅,暨荀鶴,馬兵,于和鳴,李學(xué)軍;乙酰唑胺對(duì)大鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞作用的差異蛋白分析及其與AQP1抑制的關(guān)系[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

2 ;Effects of acetazolamide and anordiol on osmotic water permeability in AQP1-cRNA injected Xenopus oocyte[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年01期

3 ;Acetazolamide inhibits aquaporin-1 protein expression and angiogenesis[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年06期

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1 汪匯;面神經(jīng)離斷傷后面神經(jīng)管內(nèi)神經(jīng)水腫及AQP1表達(dá)變化情況的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1468889