本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 RNA編輯 選擇性剪接 RT-PCR 選擇性剪接 剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸 凋亡 流式細(xì)胞術(shù)　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ADAR2mRNA前體選擇性剪接模式的分析 目的：比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中ADAR2mRNA前體選擇性剪接模式的差別。 方法：RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞中GluR2Q/R位點(diǎn)的A-to-I編輯水平；Real-time PCR方法檢測(cè)ADAR2mRNA的表達(dá)量；RT-PCR及測(cè)序比對(duì)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ADAR2mRNA前體的選擇性剪接位點(diǎn)，根據(jù)鑒定出的選擇性剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，Real-time PCR方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中不同剪接轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量，比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中ADAR2mRNA前體剪接模式的差異。結(jié)果：膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172中GluR2Q/R位點(diǎn)的A-to-I編輯水平明顯下降（P＜0.01），ADAR2mRNA總的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中均檢測(cè)到ADAR2mRNA前體有3個(gè)剪接位點(diǎn)：第1個(gè)剪接位點(diǎn)位于外顯子-1和外顯子1之間，產(chǎn)生Exon1a；第2個(gè)剪接位點(diǎn)導(dǎo)致Exon2缺失；第3個(gè)剪接位點(diǎn)位于催化活性區(qū)域，引起Exon5a的插入。其中第3個(gè)位點(diǎn)的剪接水平在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞中存在差異。Real-time PCR檢測(cè)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172中Exon1a(-)/Exon1a(+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中Exon1a(-)/Exon1a(+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值比較，顯著降低（P＜0.01）。 結(jié)論：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GluR2Q/R位點(diǎn)的A-to-I編輯水平明顯下降。膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中ADAR2mRNA前體均有3個(gè)剪接位點(diǎn)。其中Exon5a位點(diǎn)的剪接在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在明顯差別，Exon5a(+)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增加可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ADAR2編輯活性下降的原因。 第二部分Bcl-x剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的：比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中Bcl-xmRNA前體選擇性剪接模式的差異。探討B(tài)cl-x剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸（Bcl-xSplice-switching oligonucleotides，Bcl-x SSO）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖和凋亡的影響。 方法：RT-PCR、real-time PCR結(jié)合Western blot方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中Bcl-xL和Bcl-xS的相對(duì)表達(dá)量，比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-x mRNA前體選擇性剪接模式的差異。設(shè)計(jì)靶向Bcl-x基因下游選擇性5’端剪接位點(diǎn)的剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸Bcl-x SSO，β-globin SSO作為陰性對(duì)照SSO。SSO經(jīng)2’-甲氧乙基(2’-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修飾。用脂質(zhì)體將SSO轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測(cè)Bcl-x SSO對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)U251細(xì)胞的凋亡率。RT-PCR方法檢測(cè)Bcl-xSSO對(duì)Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表達(dá)水平的影響，Western blot方法檢測(cè)Bcl-x SSO對(duì)Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251、A172中，，Bcl-xL mRNA前體的選擇性剪接存在異常，表現(xiàn)為Bcl-xL表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01），Bcl-xS表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），Bcl-xS/Bcl-xL比值在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中明顯低于正常膠質(zhì)細(xì)胞（P＜0.01）。MTT結(jié)果顯示，與Control SSO相比較，Bcl-x SSO顯著抑制U251細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到Bcl-x SSO能夠明顯促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。RT-PCR檢測(cè)Bcl-x SSO處理組Bcl-xL mRNA表達(dá)水平下降，Bcl-xS mRNA表達(dá)水平升高。Western blot檢測(cè)Bcl-x SSO處理組Bcl-xL蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-xS蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）。 結(jié)論：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Bcl-x mRNA前體的選擇性剪接存在異常，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Bcl-x SSO可特異性的作用于Bcl-x mRNA前體，調(diào)節(jié)其選擇性剪接模式從Bcl-xL轉(zhuǎn)換至Bcl-xS，進(jìn)而促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Analysis of the selective splicing pattern of ADAR2mRNA in the first part of glioma cells 鏋

本文編號(hào)：1464759