本文關(guān)鍵詞： 蛛網(wǎng)膜下腔出血 低氧誘導(dǎo)因子-1 槲皮素 早期腦損傷 海馬凋亡 血腦屏障 氧化應(yīng)激 腦水腫 腦血管痙攣　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）的死亡率和致殘率都比較高，而且病例機(jī)制復(fù)雜。除了我們熟知的72小時腦血管痙攣（cerebral vasospasm, CVS）后腦缺血造成嚴(yán)重的遲發(fā)性腦損傷（delayed brain injury, DBI）外。最近研究發(fā)現(xiàn)，72小時內(nèi)的早期腦損傷（early brain injury, EBI）包括腦灌注壓（cerebral perfusionpressure, CPP）下降、離子失衡、谷氨酸毒性、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷、血小板活化和聚集、通透性改變、細(xì)胞死亡通路激活等一系列的病理生理反應(yīng)，導(dǎo)致認(rèn)知障礙、神經(jīng)功能缺陷等，這對SAH的整體預(yù)后非常關(guān)鍵，，并且，其中的分子機(jī)制是研究熱點。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）是氧敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它調(diào)控的下游靶基因有70多個，包括血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運體等等。HIF-1包括HIF-1和HIF-1β兩個亞基，已有研究顯示在局灶性腦缺血損傷動物模型中上調(diào)HIF-1的表達(dá)可以起到神經(jīng)保護(hù)作用，但是在SAH中關(guān)于HIF-1的表達(dá)調(diào)控以及它發(fā)揮的作用還沒有明確的報道。HIF-1的特異性抑制劑有叫YC-1的化合物，它的激動劑除了低氧環(huán)境外，已有少部分實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可以上調(diào)HIF-1的表達(dá)。槲皮素是黃酮類的成份之一，它有明確的分子式，不同的化學(xué)基起到不同的作用，它具有清除氧自由基（oxygen free radicals, ROS）、抑制脂質(zhì)過氧化（lipid peroxides, LPO）的抗毒抗氧化應(yīng)激的作用，螯合鈣、鐵等離子以及修復(fù)損傷DNA的神經(jīng)保護(hù)等作用。在歐美等國家已經(jīng)作為藥物上市，國內(nèi)應(yīng)用的銀杏葉提取物、銀杏達(dá)莫注射液等藥物，其中最重要的成份就是槲皮素，但是關(guān)于槲皮素在SAH中的作用及其機(jī)制尚未見到國內(nèi)外報道。因此，深入研究HIF-1及槲皮素在SAH后早期發(fā)揮的機(jī)制及它們的相互作用，對加強(qiáng)SAH后EBI的保護(hù)有一定的作用。 本研究共分五部分實驗，實驗一是關(guān)于HIF-1在實驗性SAH模型對大鼠海馬細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙保護(hù)作用的研究。首先建立成熟、穩(wěn)定、可重復(fù)的大鼠SAH模型（枕大池二次注血模型），分為假手術(shù)組、SAH模型二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）對照組和YC-1抑制組共三組，YC-1為HIF-1的特異性抑制劑，在SAH模型建立的前30min以及后24h的時候，給大鼠腹腔注射2mg/kg的YC-1（溶于DMSO），DMSO對照組注射相同劑量的DMSO，假手術(shù)組腹腔未注射藥物。然后在48h時，通過免疫組化和Western blot觀察HIF-1和它的下游靶分子VEGF、EPO、GLUT1的在各組大鼠海馬的表達(dá)變化；進(jìn)一步通過免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化、Westernblot檢測海馬Caspase-3的蛋白表達(dá)和酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）測定海馬細(xì)胞死亡DNA斷片，通過統(tǒng)計分析，以明確各組大鼠海馬凋亡情況；最后通過Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）測定各組大鼠的逃避時間和路程、目標(biāo)象限停留時間和距離，統(tǒng)計比較各組大鼠認(rèn)知功能損傷變化。結(jié)果顯示在SAH模型建立48h，大鼠海馬HIF-1和它的下游分子VEGF、EPO、GLUT1的表達(dá)增加（P 0.01），YC-1抑制組這四種分子的表達(dá)減少（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細(xì)胞增多（P0.01），海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞死亡的DNA斷片增加（P0.01），與DMSO對照組相比，YC-1抑制組大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細(xì)胞進(jìn)一步增多（P 0.01），海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞死亡的DNA斷片進(jìn)一步增加（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠在MWM中的逃避時間和路程延長（P 0.01），在目標(biāo)象限的停留時間和距離增加（P 0.01），與DMSO對照組相比，YC-1抑制組大鼠在MWM中的逃避時間和路程進(jìn)一步延長（P0.01），在目標(biāo)象限的停留時間和距離進(jìn)一步增加（P 0.01）。實驗一的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48h，HIF-1及其效應(yīng)分子VEGF、EPO、GLUT1在海馬的表達(dá)增加，而抑制它們的表達(dá)會惡化海馬細(xì)胞的凋亡，降低大鼠的認(rèn)知能力，這提示在SAH早期，HIF-1可能參與了海馬細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能損傷的保護(hù)。 實驗二是關(guān)于HIF-1在實驗性SAH模型對大鼠血腦屏障（blood brain barrier,BBB）的作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分為假手術(shù)組、DMSO對照組和YC-1抑制組共三組，給藥方案同實驗一；然后在48h時，通過Westernblot觀察HIF-1被YC-1抑制后各組大鼠腦Occludin、Claudin-5蛋白的表達(dá)變化；進(jìn)一步通過伊文思藍(lán)（Evans blue）染色觀察各組大鼠腦藍(lán)染變化、分光光度計測定各組大鼠腦伊文思藍(lán)含量，通過統(tǒng)計分析，以明確各組大鼠BBB損傷變化情況。結(jié)果顯示在SAH模型建立48h，BBB損傷的標(biāo)志物Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)增加（P0.01），YC-1抑制組大鼠腦Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)與DMSO對照組相比則明顯減少（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠腦的伊文思藍(lán)染色明顯，YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍(lán)染色與DMSO對照組相比則明顯減淡，伊文思藍(lán)定量分析顯示在SAH模型建立48h，大鼠腦的伊文思藍(lán)含量增加（P0.01），YC-1抑制組大鼠腦伊文思藍(lán)含量與DMSO對照組相比則明顯減少（P 0.01）。實驗二的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48h，HIF-1的表達(dá)減少降低了BBB的通透性，減輕了BBB損傷，提示在SAH早期，HIF-1可能參與并惡化了BBB的損傷。實驗一和實驗二的結(jié)果提示HIF-1在SAH早期可能發(fā)揮了雙向調(diào)節(jié)作用。 實驗三是關(guān)于槲皮素在實驗性SAH模型對大鼠腦氧化應(yīng)激和腦水腫保護(hù)作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分為假手術(shù)組、SAH模型生理鹽水對照組、槲皮素10mg/kg劑量組、槲皮素50mg/kg劑量組共四組，在SAH模型建立后30min、12h及24h的時候，分別給槲皮素10mg/kg劑量組和50mg/kg劑量組大鼠腹腔按體重注射10mg/kg和50mg/kg的槲皮素，生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組腹腔未注射藥物。然后在48h時，通過改良的嚙齒類動物神經(jīng)系統(tǒng)功能評分表對各組大鼠進(jìn)行評分，觀察神經(jīng)功能缺失情況（分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能障礙越重）；然后通過ELISA對各組大鼠腦皮層抗氧化酶銅、鋅離子超氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase, CuZn-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase, GSH-Px）的測定，以及反映脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)丙二醛（malonaldehyde,MDA）的測定，明確槲皮素的抗氧化應(yīng)激能力；進(jìn)一步通過免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化、Western blot檢測海馬Caspase-3的蛋白表達(dá)，通過統(tǒng)計分析，以明確各組大鼠海馬凋亡情況；最后通過濕/干法測定各組大鼠的腦組織含水量，以明確各組大鼠的腦水腫情況。結(jié)果顯示在SAH模型建立48h，大鼠神經(jīng)功能評分增加（P0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠的神經(jīng)功能評分與生理鹽水對照組相比明顯降低（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠腦皮層CuZn-SOD和GSH-Px活性下降（P 0.01），MDA水平升高（P 0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠的腦皮層CuZn-SOD和GSH-Px活性與生理鹽水對照組相比明顯升高（P0.01），MDA水平下降（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細(xì)胞增多（P 0.01），海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)增加（P 0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比，海馬CA1區(qū)的Caspase-3陽性細(xì)胞明顯減少（P0.01），海馬的Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠腦組織水含量增加（P 0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠的腦組織水含量與生理鹽水對照組相比明顯降低（P0.01）。實驗三的結(jié)果表明在SAH模型建立48h，50mg/kg劑量的槲皮素可以增強(qiáng)大鼠腦的抗氧化應(yīng)激酶活性及減輕脂質(zhì)過氧化程度，可以減輕海馬凋亡和腦水腫，并可以減輕大鼠神經(jīng)功能障礙，但10mg/kg劑量槲皮素沒有起到這些作用，提示在SAH早期，合適劑量的槲皮素治療可以通過抗氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)元凋亡和減輕腦水腫等方面起到降低SAH后EBI程度的作用。 實驗四是關(guān)于槲皮素在實驗性SAH模型對大鼠腦基底動脈（basilar artery, BA）腦血管痙攣（cerebral vasospasm, CVS）作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分為假手術(shù)組、SAH模型生理鹽水對照組、槲皮素10mg/kg劑量組、槲皮素50mg/kg劑量組共四組，在SAH模型建立前半個月的每天1次，建立后30min、12h及24h的時候，分別給槲皮素10mg/kg劑量組和50mg/kg劑量組大鼠腹腔按體重注射10mg/kg和50mg/kg的槲皮素，生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組腹腔未注射藥物；然后在72h時，通過基底動脈切片的HE染色觀察各組大鼠BA管腔直徑、管壁厚度，并計算各組大鼠BA面積進(jìn)行比較；進(jìn)一步通過Western blot檢測各組大鼠BA內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）蛋白的表達(dá)變化；最后通過ELISA測定各組大鼠血清eNOS的濃度。結(jié)果顯示在生理鹽水對照組，大鼠BA管腔內(nèi)有血栓組織，血管壁的厚度增加，管腔直徑變短，BA面積變�。≒ 0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比，血管壁的厚度增加，管腔直徑變長，BA面積變大（P0.01）；在SAH模型建立72h，大鼠BA的eNOS蛋白表達(dá)減少（P0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比，大鼠BA的eNOS蛋白表達(dá)明顯增加（P 0.01）；在SAH模型建立72h，大鼠血清eNOS濃度降低（P0.01），10mg/kg劑量槲皮素治療組與生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P0.05），而50mg/kg劑量槲皮素治療組大鼠與生理鹽水對照組相比，大鼠血清eNOS濃度明顯升高（P0.01）；實驗四的結(jié)果表明在SAH模型建立72h，50mg/kg劑量的槲皮素治療可以增加大鼠BA中eNOS蛋白的表達(dá)和血清eNOS的濃度，可以緩解腦BA痙攣，但10mg/kg劑量槲皮素沒有起到這些作用，提示合適劑量的槲皮素治療可以通過增加BA內(nèi)eNOS蛋白的表達(dá)和提高血清eNOS濃度等方面起到在SAH后早期抗CVS的作用。 實驗五是關(guān)于槲皮素在實驗性SAH模型對大鼠海馬HIF-1的調(diào)節(jié)作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分為假手術(shù)組、SAH模型生理鹽水對照組和槲皮素組共三組，在SAH模型建立前半個月的每天1次，建立后30min、12h及24h的時候，給槲皮素組大鼠腹腔按體重注射50mg/kg的槲皮素，生理鹽水對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組腹腔未注射藥物；然后在48h時，通過免疫組化觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)HIF-1的形態(tài)學(xué)表達(dá)變化；進(jìn)一步通過Western blot檢測各組大鼠海馬HIF-1的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示在SAH模型建立48h，大鼠海馬CA1區(qū)的HIF-1陽性表達(dá)增多（P 0.01），與生理鹽水對照組相比，槲皮素組大鼠海馬CA1區(qū)的HIF-1陽性表達(dá)進(jìn)一步增多（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海馬的HIF-1蛋白增多（P 0.01），與生理鹽水對照組相比，槲皮素組大鼠海馬的HIF-1蛋白進(jìn)一步增多（P0.01）。實驗五的研究結(jié)果表明在大鼠SAH模型48h，槲皮素可以上調(diào)HIF-1在海馬的表達(dá)，這提示在SAH早期，槲皮素也可能通過HIF-1這一途徑發(fā)揮了腦保護(hù)作用。 本論文首次在大鼠SAH模型早期，觀測了HIF-1對海馬凋亡、認(rèn)知功能和BBB功能的影響，并檢測了槲皮素對腦氧化應(yīng)激、腦水腫和CVS的影響，進(jìn)一步研究了槲皮素對HIF-1的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示HIF-1在SAH早期可能發(fā)揮了雙向調(diào)節(jié)作用，合適劑量的槲皮素可以降低SAH后EBI程度，并且可能通過HIF-1這一途徑起到了腦保護(hù)作用，但仍需要進(jìn)一步的體外試驗，以及深入研究它們的相互作用機(jī)制，以為提高SAH救治成功率提供可能的治療靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.35

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 George C.Y. Chiou;;Effect of Quercetin on Formation of Choroidal Neovascularization (CNV) in Age-related Macular Degeneration (AMD)[J];Eye Science;2011年01期

本文編號：1461010