本文關(guān)鍵詞： 腦缺血 阿司匹林 氯吡格雷 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 療效　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:腦梗死(Cerebral infarction,CI)又稱缺血性腦卒中,指因腦內(nèi)局部血液供應(yīng)不足導(dǎo)致腦組織缺血缺氧,引起局限性壞死或腦軟化。目前,在我國已有CI患者700萬人,平均發(fā)病率為(116-219)/10萬人口,年死亡率為(58~142)/10萬人口,是致死率最高的疾病之一。CI具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率,其中不同程度喪失勞動能力者可達(dá)75%,是導(dǎo)致致殘的最常見疾病,也是導(dǎo)致我國成人殘疾的首要原因。近年來,隨著我國老齡化進(jìn)程的加速,CI發(fā)病率也逐年上升。CI臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜,疾病的程度主要取決于梗死灶的大小和部位,表現(xiàn)為局灶性的神經(jīng)功能缺損,如頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、運(yùn)動性和(或)感覺性失語、肢體偏癱、大小便失禁等。由于CI對患者家庭、社會造成重大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān),已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此,不斷探索合理、有效的CI治療方法,降低CI的致死率、致殘率及復(fù)發(fā)率,已成為神經(jīng)病學(xué)的重要問題。阿司匹林和氯吡格雷是目前臨床上常用的抗血小板聚集藥物,大量研究證明使用阿司匹林或氯吡格雷預(yù)防CI的復(fù)發(fā)具有重要意義,而臨床上關(guān)于阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療顱內(nèi)動脈粥樣硬化性狹窄也有報道,且兩種藥物的聯(lián)合使用已逐漸得到神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生的重視。然而,如何選擇應(yīng)用時機(jī)、藥物計量等問題仍有待研究,且尚未有關(guān)于兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用治療大鼠腦缺血再灌注動物模型的實驗報道。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一類來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,也是目前研究最多、最具有代表性和分化傾向最多的成體干細(xì)胞之一。大量的體外實驗證明,在不同誘導(dǎo)條件下,間充質(zhì)干細(xì)胞可以向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。目前,BMSCs的分離與提取方法較為成熟,安全性高,且可以通過遷移和增殖對腦組織起到中樞保護(hù)和修復(fù)作用。綜上,鑒于干細(xì)胞治療與抗血小板藥物治療的優(yōu)越性,本研究從臨床應(yīng)用意義角度出發(fā),選用阿司匹林和氯吡格雷對腦缺血再灌注大鼠模型的治療療效進(jìn)行對比分析;同時,設(shè)置聯(lián)合用藥組(阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷用藥)觀察單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥后對大鼠神經(jīng)功能、腦組織蛋白表達(dá)等方面的影響;此外,首次提出在動物模型中驗證干細(xì)胞聯(lián)合兩種抗血小板聚集藥物治療腦缺血再灌注大鼠模型的設(shè)想,同時比較干細(xì)胞治療與藥物治療對大鼠模型的療效,為臨床實際應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。目的:(1)觀察、比較抗血小板聚集藥物阿司匹林、氯吡格雷及兩者聯(lián)合用藥治療腦缺血再灌注模型的療效;(2)觀察、比較BMSCs治療與抗血小板聚集藥物治療腦缺血再灌注模型的療效(3)為CI患者的治療提出一條新的途徑,即干細(xì)胞聯(lián)合抗血小板聚集藥物治療CI患者,并為其臨床應(yīng)用提供真實的實驗數(shù)據(jù)和可靠的理論支持。方法:選擇3-4月齡的健康雄性Sprague Dawley大鼠,體重250-300 g,構(gòu)建大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artey occolusion,MCAO)模型,成模后隨機(jī)將MCAO模型大鼠分為9組(n=13):假手術(shù)組(A組)、模型自然恢復(fù)組(B組)、阿司匹林治療組(C組)、氯吡格雷治療組(D組)、阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療組(E組)、BMSCs治療組(F組)、BMSCs聯(lián)合阿司匹林治療組(G組)、BMSCs聯(lián)合氯吡格雷治療組(H組)和BMSCs聯(lián)合阿司匹林和氯吡格雷治療組(I組)。其中,B組不做任何干預(yù),C和G組每天給予阿司匹林灌胃(每只10.3mg/kg/d),D和H組每天給予氯吡格雷灌胃(每只7.8 mg/kg/d),E和I組每天給予阿司匹林和氯吡格雷灌胃(每只阿司匹林10.3 mg/kg/d,氯吡格雷7.8mg/kg/d),F、G、H和I組在成模后第7d給予尾靜脈注射BMSCs(每只2×106/m L,1m L)。在治療的第15d,采用Morris水迷宮評價各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。實驗的第21d進(jìn)行標(biāo)本取材,一部分大鼠10%水合氯醛麻醉后心臟取血,斷頭取海馬組織,另一部分大鼠進(jìn)行心臟灌流,固定腦部準(zhǔn)備進(jìn)行石蠟包埋和組織切片。血清采用ELISA試劑盒檢測炎癥因子含量差異;切片采用HE染色和尼氏染色觀察腦組織大體變化;采用TUNEL染色觀察大鼠腦部組織神經(jīng)元凋亡;采用免疫組織化學(xué)染色觀察不同神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)情況;采用蛋白印跡法(Western Blot)檢測凋亡信號通路基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3和Surivivin)表達(dá)的變化。結(jié)果:(1)成功建立MCAO大鼠模型。(2)成功分離、培養(yǎng)BMSCs,并成功進(jìn)行尾靜脈移植。(3)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示:與B組比較,其他治療組大鼠神經(jīng)功能得分均增高,且I組最高(p0.05);藥物治療組相比,C組評分最低,E組最高(p0.05);BMSCs治療組神經(jīng)功能評分高于藥物治療組(p0.05)。Morris水迷宮結(jié)果顯示:同一時間點(diǎn)不同治療組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短(p0.05),與B組相比,各治療組大鼠逃避潛伏期均縮短,且E組逃避潛伏期短于C、D組,BMSCs組短于C、D、E組,其中I組逃避潛伏期最短;不同時間點(diǎn)同一治療組,隨著時間的延長,逃避潛伏期也逐漸縮短(p0.05)。說明,抗血小板聚集藥物可有效改善MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,且聯(lián)合應(yīng)用效果更佳,此外I組治療效果最佳。(4)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠炎性損傷的影響。ELISA結(jié)果顯示:與B組相比,各治療組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HSP-70和ACTH值均降低(p0.05),且單純用藥組、聯(lián)合用藥組、BMSCs移植組和BMSC聯(lián)合藥物治療組血清中炎性因子濃度逐漸降低,其中I組大鼠血清炎性因子水平最低(p0.05)。說明,抗血小板聚集藥物可有效降低MCAO大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),且BMSCs聯(lián)合藥物治療效果最佳。(5)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠腦部組織病理學(xué)的影響。HE染色片結(jié)果可以看出B組腦部缺血區(qū)腦組織稀疏、神經(jīng)細(xì)胞變形、核固縮或核碎裂,海馬CA1、CA4區(qū)神經(jīng)細(xì)胞大量壞死,而A組神經(jīng)細(xì)胞正常;C、D治療組大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死,但少于B組;E治療組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量少于上述各組;BMSCs治療組細(xì)胞壞死數(shù)量少于藥物治療組,且聯(lián)合藥物治療后病變最輕。尼氏染色片結(jié)果:A組大鼠腦部組織鏡下觀察尼氏小體呈藍(lán)色,細(xì)胞內(nèi)尼氏小體多見,而B組尼氏小體罕見,且缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死、數(shù)量減少,少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體也消失、胞核固縮;不同藥物治療組尼氏小體數(shù)量有所增加,且E組尼氏小體數(shù)量多于C、D組;BMSCs移植治療組尼氏小體明顯增多,且I組數(shù)量最多。(6)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠腦部海馬神經(jīng)元凋亡的影響。TUNEL染色結(jié)果顯示:B組大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生明顯的變性和死亡,損傷部位主要位于缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬區(qū)域,凋亡率為51.33%,而不同治療組與B組相比細(xì)胞凋亡率明顯降低(p0.05);D組細(xì)胞凋亡率低于C組(p0.05),而E組細(xì)胞凋亡率低于C、D組;BMSCs治療組細(xì)胞凋亡率36.72%低于藥物治療組,且BMSCs治療組細(xì)胞凋亡率逐漸降低,I組細(xì)胞凋亡率最低。(7)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠腦神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的影響。結(jié)果顯示:神經(jīng)營養(yǎng)因子GFAP、GDNF和NSE在B組中罕見,隨著治療方式的不同,陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,鏡下多見細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)胞;不同治療方法相比,聯(lián)合兩種抗血小板聚集藥物組陽性細(xì)胞數(shù)量多于單純一種藥物治療組,而BMSCs聯(lián)合藥物治療后,陽性細(xì)胞數(shù)增多。(8)抗血小板聚集藥物聯(lián)合BMSCs治療對MCAO大鼠腦組織蛋白含量的影響。Western blot檢測結(jié)果顯示:A組不表達(dá)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,與B組相比其他治療組surivivin表達(dá)逐漸增加,而caspase-3表達(dá)逐漸減少;其中,聯(lián)合兩種藥物治療組surivivin表達(dá)量高于單純一種藥物治療(p0.05);C與D組相比蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);BMSCs治療組surivivin表達(dá)量高于藥物治療組,而caspase-3表達(dá)量低于藥物治療組(p0.05);BMSCs聯(lián)合藥物治療組surivivin表達(dá)量高于其他組,而I組surivivin表達(dá)量最高,caspase-3表達(dá)量最低(p0.05)。結(jié)論:(1)兩種抗血小板聚集藥物阿司匹林和氯吡格雷同時應(yīng)用于治療大鼠MCAO模型,療效優(yōu)于單純一種藥物治療;(2)BMSCs聯(lián)合阿司匹林或聯(lián)合氯吡格雷治療大鼠MCAO模型,療效優(yōu)于單純給予抗血小板聚集藥物治療;(3)BMSCs聯(lián)合阿司匹林及氯吡格雷兩種藥物治療大鼠MCAO模型,療效最佳。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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