本文關(guān)鍵詞： TAG-1(瞬變軸突蛋白-1) APP(淀粉樣前體蛋白) AICD(淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)段) 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞行為學(xué)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 膠質(zhì)瘤(glioma)是最常見的顱內(nèi)原位實(shí)體瘤,約占原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的29%,占惡性腦腫瘤的80%。其中惡性膠質(zhì)瘤增殖迅速、侵襲度高、致死率高,已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最難治療的疾病之一。雖然隨著臨床手術(shù)治療、放療、化療等治療技術(shù)的綜合運(yùn)用,膠質(zhì)瘤的臨床療效與預(yù)后仍然沒有明顯改善。隨著對膠質(zhì)瘤研究的深入而廣泛的開展,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stem cells, GSCs)的發(fā)現(xiàn)及其理論與研究逐漸受到關(guān)注。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是指膠質(zhì)瘤中的一小部分因具有自我更新、無限增殖和分化成瘤等干性特征的細(xì)胞,是膠質(zhì)瘤的成瘤細(xì)胞；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞因其干性特征被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)的根源。因此,有關(guān)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的行為學(xué)及其相關(guān)機(jī)制的研究,對尋找膠質(zhì)瘤更為有效的治療新“靶標(biāo)”具有重要意義。 目前研究認(rèn)為,一些相關(guān)基因、受體、信號分子的異常表達(dá)及其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能涉及膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。細(xì)胞微環(huán)境中的信號分子及其相關(guān)的信號通路也可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)行為的變化。因此,多方面了解膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的相關(guān)信號變化,發(fā)現(xiàn)新的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞信號通路并進(jìn)行深入探索已成為目前膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)。 TAG1(transient axonal glycoprotein-1,瞬變軸突糖蛋白1,也可稱為TAX1, Contactin2, CNTN2, Axoninl)是一種細(xì)胞表面黏附分子,屬于免疫球蛋白家族Contactin/F3亞家族,主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)展過程中。以往研究認(rèn)為,TAG1的生理功能主要是作為一種細(xì)胞粘附分子引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的粘附、遷移以及引導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長,但其具體的作用途徑或模式目前還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)TAG1與膠質(zhì)瘤可能相關(guān),在膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞中均有檢測出TAG1的表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)室同事的研究則發(fā)現(xiàn)TAG1信號可能通過某種細(xì)胞信號途徑以促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖的方式參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。此外,TAG1信號可能通過SHH信號通路對膠質(zhì)前體細(xì)胞起增殖促進(jìn)及分化抑制的作用。但TAG1在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的相關(guān)作用仍不清楚。 APP (Aβ前體蛋白,Amyloid β precursor protein, APP)是新發(fā)現(xiàn)的TAG1的一種受體信號。APP廣泛的表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中,在神經(jīng)干細(xì)胞中也有明確表達(dá)。研究顯示,APP作為一種維持細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)間的細(xì)胞信號,所涉及的生理作用也非常廣泛,如細(xì)胞的遷移、神經(jīng)細(xì)胞的分化與再生、突觸發(fā)育、神經(jīng)保護(hù)等。其次,APP通過特異性的水解酶的剪切所產(chǎn)生的APP胞內(nèi)剪切片段AICD (APP intracellular domain, AICD)可作為APP信號的直接傳導(dǎo)分子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn),APP及AICD均有可能與膠質(zhì)瘤相關(guān)：APP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞中存在有過表達(dá)的現(xiàn)象,這種過表達(dá)可能涉及到膠質(zhì)瘤細(xì)胞的異常增殖和異常形態(tài)；APP也可能導(dǎo)致外源性的神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化增加。而AICD可能與Notch蛋白的胞內(nèi)片段NICD相互作用,通過上調(diào)NICD及Hesl的表達(dá)或直接上調(diào)Hesl的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生,同時(shí)AICD可使神經(jīng)祖細(xì)胞的膠質(zhì)發(fā)生增加。但是APP與AICD在膠質(zhì)瘤中的具體作用及可能的機(jī)制仍不明確。 由于TAG1/APP信號最初發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞中,而在普通的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有TAG1及APP信號分子的表達(dá),故本實(shí)驗(yàn)選擇膠質(zhì)瘤干細(xì)胞為研究對象,研究TAG1/APP信號在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)情況,并對其涉及的可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討,以期為膠質(zhì)瘤的治療提供新線索。 本研究擬分為三個(gè)部分。 第一章人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：從人源性U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中分離培養(yǎng)并擴(kuò)增U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并對其干性特征進(jìn)行鑒定。為研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的信號通路奠定基礎(chǔ)。 材料與方法：采用無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+20ng/mLbFGF+20ng/mLEGF+2%B27),在1%氧濃度培養(yǎng)條件(1%O2,5%CO2,94.5%N2,98%濕度,37℃)下進(jìn)行U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離及擴(kuò)增培養(yǎng)。對擴(kuò)增所獲得的腫瘤球細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察；使用干性標(biāo)記物進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)記的鑒定；使用常規(guī)含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)進(jìn)行腫瘤球細(xì)胞的分化誘導(dǎo),鑒定分化細(xì)胞表型以檢測腫瘤球細(xì)胞的多向分化能力；通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定腫瘤球細(xì)胞的成瘤性；采用細(xì)胞增殖性實(shí)驗(yàn)CCK-8(Cell Counting Kit-8)測定并繪制腫瘤球細(xì)胞的生長曲線,以了解腫瘤球細(xì)胞的增殖特性。 結(jié)果：人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長,胞體有突起,細(xì)胞可呈梭形、星形、多角形。經(jīng)無血清培養(yǎng)基低氧濃度培養(yǎng),可呈懸浮狀態(tài)生長,形成懸浮腫瘤克隆球；這些腫瘤球細(xì)胞可以被反復(fù)消化傳代至少1個(gè)月以上。使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測,所獲得的U87腫瘤球細(xì)胞可表達(dá)干性標(biāo)記物CD133和Nestin;使用流式細(xì)胞儀檢測,干性標(biāo)記物CD133和Nestin陽性率可以達(dá)到90%以上。將U87腫瘤球細(xì)胞轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化,可重新分化成貼壁細(xì)胞,形態(tài)與親本U87細(xì)胞相似,經(jīng)過神經(jīng)系統(tǒng)三系細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞)標(biāo)記物鑒定,可表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、神經(jīng)元(Ⅲ β-tubulin)、和不成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(01)標(biāo)記物。將U87腫瘤球細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下種植,可觀察到腫瘤球細(xì)胞所形成的皮下移植瘤。通過生長曲線的繪制,與普通U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長速度(1天：0.520±0.006,3天：0.690±0.010,5天：0.964±0.014)相比,U87腫瘤球細(xì)胞的生長速度(1天：0.855±0.049,3天：1.452±0.139,5天：1.925±0.051)較快,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示細(xì)胞種類和時(shí)間因素存在交互效應(yīng)(F=37.359,P=0.000)；進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析,固定三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間存在差異(p0.05)。 結(jié)論：人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中存在有具無限增殖、自我更新及多向分化潛能的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,通過低氧無血清培養(yǎng)基可以對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)及有效擴(kuò)增。 第二章TAG1/APP信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化中的表達(dá) 目的：研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化培養(yǎng)過程中TAG1/APP信號的表達(dá)情況,以分析TAG1/APP信號與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系。 方法：以體外分離培養(yǎng)的第5代以后的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞模型,使用無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+bFGF20ng/ml、EGF20ng/ml、B270.2%)在常規(guī)氧濃度37℃,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行增殖培養(yǎng)3天；含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在常規(guī)氧濃度37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化0、1、5天；分別通過使用qRT-PCR及Western blot方法,檢測細(xì)胞中TAG1和APP的表達(dá)。 結(jié)果：U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈懸浮球樣增殖擴(kuò)增,通過第5代以上的收集球細(xì)胞進(jìn)行TAG1、APP的qRT-PCR基因表達(dá)檢測和Western blot蛋白表達(dá)檢測。與普通U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比較,在U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖時(shí),TAG1的mRNA表達(dá)(2.427±0.690)和APP的mRNA表達(dá)(1.413±0.146)均呈現(xiàn)增強(qiáng)(t=-3.581,P=0.023及t=-4.913,P=0.039); TAG1和APP的蛋白表達(dá)在U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(TAG1:0.203±0.042, APP:0.643±0.015)中也較普通U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中(TAG1:0.103±0.025, APP:0.497±0.021)均有增強(qiáng)(t=-3.560,P=0.024及t=-9.839,P=0.001)。U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在含10%胎牛血清的普通培養(yǎng)基中分化時(shí),隨著分化的進(jìn)行,可以觀察到TAG1及APP的mRNA在分化第1天(TAG1：1.033±0.087,APP：0.927±0.065)仍然有較高表達(dá),與未分化時(shí)TAG1及APP的mRNA表達(dá)(均為1)相比較差異不顯著；而隨著分化出的成熟普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞比例增多,TAG1及APP mRNA的表達(dá)在第5天出現(xiàn)下降(TAG1：0.527±0.110,APP：0.533±0.098),與分化第1天相比較差異顯著(分別是t=6.258,P=0.003和t=5.785,P=0.004)。分化過程中,TAG1與APP蛋白的表達(dá)情況與其mRNA情況相一致。與未分化狀態(tài)相比較(TAG1:0.557±0.021, APP:0.663±0.021),在U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化第1天TAG1及APP的蛋白表達(dá)(TAG1：0.523±0.032,APP：0.623±0.031)無明顯減弱,統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著；而隨著分化過程的進(jìn)展,TAG1及APP的表達(dá)減弱(TAG1:0.417±0.015, APP:0.477±0.015),與分化第1天的TAG1及APP的相對表達(dá)量相比較出現(xiàn)顯著性差異(P=0.002和P=0.000)。 結(jié)論：TAGl/APP信號在U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中存在異常高表達(dá)；TAG1/APP信號通路的異常可能涉及U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中增殖的維持及分化的啟動。 第三章TAG1/APP信號通路對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用 目的：干擾U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中TAG1的表達(dá),觀察下調(diào)TAG1信號后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化行為的變化及對EGFR與Hes1信號的影響,以探討TAG1/APP/EGFR和TAG1/APP/Hes1信號調(diào)控對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的潛在致病機(jī)制。 方法：根據(jù)人CNTN2基因序列,設(shè)計(jì)構(gòu)建4個(gè)miRNA干擾載體(CNTN2-1、2、3、4),并通過測序進(jìn)行鑒定；通過對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后用Western blot進(jìn)行干擾效率篩選；對干擾效率最好的一組進(jìn)行進(jìn)行慢病毒構(gòu)建包裝。按照MOI=100對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,72小時(shí)后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及綠色熒光的表達(dá)。使用CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測及干細(xì)胞球數(shù)量與大小測定評估RNAi-TAGl對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的影響,使用U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化后GFAP表達(dá)量及U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植后成瘤大小評估RNAi-TAG1對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的影響。使用qRT-PCR及Western blot方法,檢測增殖狀態(tài)下及分化過程中AICD、EGFR、HES1表達(dá)的變化。 結(jié)果：經(jīng)過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CNTN2-2所產(chǎn)生的干擾效果最佳,將其成功構(gòu)建為Lenti-EGFP-CNTN2-miR,并以Lenti-EGFP-NC-miR作為空病毒對照。對TAG1信號進(jìn)行RNAi后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖受到抑制,與Lenti-EGFP-NC-miR空病毒對照組各時(shí)間點(diǎn)增殖活力(48小時(shí)：0.757±0.012,72小時(shí)：1.297±0.018,96小時(shí)：1.377±0.044)相比較,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干擾組CCK-8各時(shí)間點(diǎn)增殖活力(48小時(shí)：0.578±0.008,72小時(shí)：0.963±0.100,96小時(shí)：1.154±0.035)；繪制生長曲線進(jìn)行析因分析顯示細(xì)胞種類和時(shí)間因素存在交互效應(yīng)(P=-3.202,P=-0.038),因此著重進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析,固定三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組均有差異(P0.05); RNAi-CNTN2組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖活力明顯降低(P0.05)。對干擾后U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外成球情況進(jìn)行分析；腫瘤球的數(shù)量在RNAi-CNTN2組：24.000±3.606,在Neg Ctrl組：32.667±3.055;多重比較結(jié)果顯示,與Neg Ctrl組相比較,RNAi-CNTN2組腫瘤球的數(shù)量明顯減少(P=0.015)。腫瘤球的直徑在RNAi-CNTN2組：89.337±10.097,在Neg Ctrl組：124.193±21.759；多重比較結(jié)果顯示,與Neg Ctrl組相比較,RNAi-CNTN2組腫瘤球的直徑明顯減小(P=0.008)。對TAGl信號進(jìn)行RNAi后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化也受到抑制,與Lenti-EGFP-NC-miR空病毒對照組相比,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干擾組分化第5天時(shí)的GFAP表達(dá)量均較未轉(zhuǎn)染空白對照組明顯降低(RNAi-CNTN2組：0.1647±0.004,Neg Ctrl組：0.5656±0.008；F=1651.841,P=0.000)；20天時(shí)裸鼠皮下腫瘤的體積有明顯的較小(RNAi-CNTN2組：1638.385±329.656,Neg Ctrl組：2383.348±301.801;F=9.817,P=0.008)。Western blot檢測結(jié)果顯示,RNAi-TAG1轉(zhuǎn)染48小時(shí)后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,與空病毒轉(zhuǎn)染對照組相比較,RNAi-CNTN2組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中APP表達(dá)無明顯變化(F=9.719,P=0.131)；AICD的表達(dá)則呈現(xiàn)明顯減少(RNAi-CNTN2組：0.302±0.007,Neg Ctrl組：0.865±0.056；F=121.417,P=0.006)。在誘導(dǎo)分化后第3天時(shí),Lenti-EGFP-CNTN2-miR組中U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的GFAP的蛋白表達(dá)明顯減少(F=1651.841,P=0.000)。通過qRT-PCR檢測顯示,EGFR和Hes1的基因表達(dá),RNAi-CNTN2組較Neg Ctrl組明顯降低(F=26.967,P=0.048,和F=1598.701,p=0.000)。Western blot檢測結(jié)果顯示,EGFR蛋白相對表達(dá)量(RNAi-CNTN2組：0.121±0.011,Neg Ctrl組：0.754±0.021),Hesl蛋白的相對表達(dá)量(RNAi-CNTN2組：0.133±0.004,Neg Ctrl組：0.418±0.003),與Neg Ctr1組相比較,RNAi-CNTN2組中EGFR和Hes1的蛋白表達(dá)明顯減少,差異具有顯著性(F=765.277,P=0.000和F=3580.478,P=0.000)。 結(jié)論：RNAi-TAG1信號可能通過TAG1/APP/AICD/Hes1信號及TAG1/APP/AICD/EGFR信號途徑對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖與分化產(chǎn)生抑制作用,抑制TAG1信號可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的線索。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1448278