本文關(guān)鍵詞：小膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境對神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的影響

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【摘要】：目的：本文通過體外實(shí)驗(yàn)來研究小膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境對神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的影響,并初步探討其可能的相關(guān)作用機(jī)制,為帕金森病的細(xì)胞移植治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：1.神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分離、培養(yǎng)、鑒定：取懷孕14-15天的SD胎鼠,顯微鏡下分離中腦,經(jīng)胰蛋白酶消化分離制成細(xì)胞懸液,加入B27、EGF、bFGF經(jīng)計數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度后無血清培養(yǎng)。Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞后按時半量換液培養(yǎng)備用。2.小膠質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定：取新出生1天的SD大鼠,分離皮質(zhì)腦組織,經(jīng)機(jī)械分離和胰蛋白酶消化分離制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度接種培養(yǎng)數(shù)天。根據(jù)巨噬細(xì)胞分化抗原-1(Mac-1)鑒定陽性細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度按時半量換液培養(yǎng)備用。3.小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)：采用Transwell系統(tǒng),下層培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,上層培養(yǎng)NSCs,分組如下：(1)NSCs單獨(dú)培養(yǎng)；(2)正常小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs以1：4比例共培養(yǎng)。共培養(yǎng)3d、6d、9d后觀察NSCs的存活及是否向多巴胺能(DA)神經(jīng)元分化等。4.檢測NSCs向DA神經(jīng)元的分化情況：采用實(shí)時熒光PCR、Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測DA能神經(jīng)元分化和成熟相關(guān)基因及蛋白(VMAT2, DAT, TH, FOX2, Pitx3, Lmx1a, Otx2)的表達(dá)。結(jié)果：1.體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中可見折光性良好懸浮生成的典型神經(jīng)球,部分貼壁生長,Nestin鑒定陽性；小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中可見細(xì)胞分層現(xiàn)象,Mac-1鑒定陽性,可用于后續(xù)試驗(yàn)。2.實(shí)時熒光PCR檢測到共培養(yǎng)組比單獨(dú)神經(jīng)干細(xì)胞組DAT、FOXA2、Lmx1a、 Otx2、Pitx3、TH、VAMT2基因中mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度上調(diào)(P0.05),具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.Western Blot檢測到共培養(yǎng)組與多巴胺能神經(jīng)元成熟相關(guān)的蛋白較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯增加(P0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義。4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可看到共培養(yǎng)組熒光信號較單獨(dú)培養(yǎng)組增強(qiáng),與Western B1ot結(jié)果相一致。結(jié)論：我們從SD大鼠腦組織中成功分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,nestin可作為神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定,MAC-1可作為小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定。小膠質(zhì)細(xì)胞通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞Pitx3、Otx3、TH、Lmx1a、Vmat2、DAT、Foxa2基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)向巴胺能神經(jīng)元的分化、成熟。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

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本文編號：1288856