本文關(guān)鍵詞：注射用丹參多酚酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血小鼠神經(jīng)功能改善和神經(jīng)再生的影響及其作用機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:腦卒中不僅會(huì)造成急性期腦損傷,由于損傷腦組織恢復(fù)不佳,也會(huì)引起恢復(fù)期運(yùn)動(dòng)功能的損傷,造成極高的致殘率。由于rt-PA過窄的時(shí)間窗限制,在腦卒中發(fā)生后的24小時(shí)內(nèi)患者常常不能得到及時(shí)治療,因此開始于腦卒中發(fā)生24小時(shí)之后的延遲治療越來越受到人們的重視與關(guān)注。丹參作為一種中藥,已被各種研究證實(shí)具備神經(jīng)保護(hù)作用,并廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中患者。注射用丹參多酚酸是從丹參中提取的復(fù)方成分,已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在腦卒中的急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用,但對(duì)于這種藥物對(duì)腦卒中延遲治療效果及其是否可改善腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)及可能的作用機(jī)制卻研究甚少。成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)存在兩個(gè)能產(chǎn)生大量神經(jīng)元的生發(fā)區(qū),分別為側(cè)腦室的腦室下帶(subventricular zone,SVZ)和海馬的顆粒下帶(subgranular zone,SGZ)。在一些刺激如缺血性腦卒中的作用下,SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞能被激活而增殖并向缺血半暗帶遷移,分化成熟以取代梗死區(qū)受損的神經(jīng)元,以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)和多種器官的正常形成和構(gòu)建中起重要作用,近年來該信號(hào)因與神經(jīng)組織發(fā)生及神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化、遷移的密切關(guān)系而備受關(guān)注。一些神經(jīng)生長(zhǎng)因子可促進(jìn)成年動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)再生,在缺血性腦卒中的恢復(fù)期與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。Brain derived neurotrophic factor(BDNF)和Nerve Growth Facto(NGF)已證實(shí)在生理和病理?xiàng)l件下均與腦內(nèi)SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化及遷移緊密相關(guān)。但是,對(duì)于Shh信號(hào)通路與BDNF及NGF表達(dá)的關(guān)系仍知之甚少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究注射用丹參多酚酸的延遲性治療可否促進(jìn)缺血性腦卒中后恢復(fù)期神經(jīng)功能的恢復(fù)和神經(jīng)再生,且Shh信號(hào)通路是否為該藥物長(zhǎng)時(shí)程應(yīng)用的作用靶點(diǎn)。方法:采用永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈并在顯微鏡下燒灼右側(cè)大腦中動(dòng)脈的皮層分支以制備C57BL/6小鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham),梗死組(MCAO),小劑量用藥組(Sals-L),大劑量用藥組(Sals-H),抑制劑組(CYC),抑制劑+用藥組(CYC+Sals)。各組小鼠分別于造模后24小時(shí)開始腹腔給予不同劑量的藥物(15 mg/kg,30 mg/kg)或抑制劑(10 mg/kg),連續(xù)14天。分別于術(shù)后1、7、14、21、28天對(duì)各組小鼠進(jìn)行Rotarod及m NSS神經(jīng)功能評(píng)分,于28天用HE染色法測(cè)定腦梗死體積,于術(shù)后7、14、28天用免疫熒光染色測(cè)定神經(jīng)再生相關(guān)指標(biāo)(包括神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化、遷移及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖、分化等的相關(guān)指標(biāo)),于術(shù)后3、7、14天用免疫印記(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)測(cè)定Shh信號(hào)通路上相關(guān)因子(Shh,Ptch,Gli1)及BDNF、NGF的蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果:1注射用丹參多酚酸改善了腦缺血小鼠的神經(jīng)功能對(duì)梗死組、小劑量用藥組、大劑量用藥組、抑制劑組、抑制劑+用藥組組小鼠于術(shù)后1、7、14、21、28天進(jìn)行Rotarod和m NSS神經(jīng)功能評(píng)分。梗死后24小時(shí),各組小鼠均顯示了神經(jīng)缺損癥狀,各組間神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分未見明顯差異(P0.05)。與梗死組相比,大劑量用藥組的神經(jīng)功能評(píng)分在14天(Rotarod)及21天(m NSS)明顯改善,且持續(xù)到梗死后第28天,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與大劑量用藥組相比,抑制劑組、抑制劑+用藥組(劑量同大劑量用藥組)的神經(jīng)功能評(píng)分在14天(Rotarod)及21天(m NSS)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但兩者與梗死組相比在任何時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2注射用丹參多酚酸對(duì)腦梗死體積無影響造模后第28天,Sham組腦組織未見梗死灶,用藥組梗死體積較梗死組相比未見明顯減(Sals vs.MCAO:11.39%±1.73%vs.11.60%±2.07%,P0.05)。3注射用丹參多酚酸通過介導(dǎo)Shh信號(hào)通路促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)再生Confocal結(jié)果顯示,術(shù)后7、14、28天,用藥組(之后實(shí)驗(yàn)中用藥組劑量同大劑量用藥組)同梗死組相比,梗死側(cè)d SVZ區(qū)Brd U+細(xì)胞數(shù)及d SVZ區(qū)、v SVZ區(qū)DCX密度顯著增多,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),梗死對(duì)側(cè)未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),抑制劑+用藥組同用藥組相比在梗死側(cè)上述指標(biāo)均有顯著性下降(P0.05);DCX與Brd U共標(biāo)表明梗死后神經(jīng)再生,且造模后7、14、28天用藥組DCX/Brd U共標(biāo)細(xì)胞數(shù)占Brd U陽性細(xì)胞百分比較梗死組相比在梗死側(cè)具有顯著性增加,同時(shí)應(yīng)用抑制劑則可逆轉(zhuǎn)上述作用(P0.05)。Confocal結(jié)果顯示,在梗死灶周邊的皮層和紋狀體也可觀察到DCX+細(xì)胞,說明神經(jīng)前體細(xì)胞在梗死后發(fā)生了由SVZ區(qū)至梗死區(qū)的遷移。在梗死區(qū)域周邊可以觀察到Neu N、GFAP、Iba1與Brd U的共標(biāo),說明在腦梗死發(fā)生后神經(jīng)前體細(xì)胞可以遷移至梗死區(qū)周邊并分化成熟以取代受損的神經(jīng)細(xì)胞。通過對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的熒光染色發(fā)現(xiàn)SVZ區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞具有很多分支,梗死后28天無論用藥組還是梗死組DCX/Tuj-1共標(biāo)均占很大一部分,但用藥組DCX/MAP-2及DCX/SMI312共標(biāo)數(shù)均較梗死組增多,說明藥物可以促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的突起向成熟的樹突及軸突分化。此外我們還觀察了SVZ區(qū)及胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及分化情況。結(jié)果表明,梗死后28天,在用藥組梗死側(cè)SVZ區(qū)NG2+細(xì)胞數(shù)較梗死組相比有增多,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),此差異并未出現(xiàn)在梗死對(duì)側(cè)(P0.05)。無論在SVZ區(qū)還是梗死灶周邊的胼胝體區(qū)域均可以觀察到NG2/Brd U的共標(biāo)。此外,梗死后28天,梗死灶周圍胼胝體區(qū)用藥組CNPase/Brd U共標(biāo)細(xì)胞數(shù)占Brd U陽性細(xì)胞百分率較梗死組增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4注射用丹參多酚酸上調(diào)Shh、Ptch、Gli1的蛋白及基因表達(dá),上調(diào)BDNF及NGF的表達(dá)Confocal結(jié)果顯示DCX/Shh、Neu N/Shh、MAP-2/Shh、SMI312/Shh均有共標(biāo),且BDNF及NGF也均與DCX、Tuj-1、Neu N、MAP-2、SMI312共標(biāo)。Western blot,RT-q PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:梗死后3、7、14天,梗死組小鼠缺血側(cè)腦皮層的Shh、Ptch、Gli1的水平上調(diào),藥物干預(yù)后,其水平較梗死組相比增多,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),梗死對(duì)側(cè)皮層上述指標(biāo)未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。BDNF、NGF在梗死后第3天并未在用藥組及梗死組之間出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而第7天及第14天,梗死側(cè)皮層在用藥組兩者的表達(dá)同梗死組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),梗死對(duì)側(cè)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示:梗死后14天,抑制劑+用藥組小鼠較用藥組小鼠相比,shh信號(hào)通路上的指標(biāo)Ptch及Gli1在梗死側(cè)皮層的表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),同時(shí)BDNF和NGF的表達(dá)在梗死側(cè)皮層也下調(diào),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。但Shh的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:延遲性注射用丹參多酚酸治療可顯著改善腦缺血小鼠的神經(jīng)功能,同時(shí)可促進(jìn)梗死側(cè)SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化、遷移及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖及分化,其機(jī)制可能是通過激活shh信號(hào)通路,從而上調(diào)BDNF、NGF的表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)再生過程的。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3

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