本文關(guān)鍵詞：NSCs遞送LINGO-1-Fc治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類(lèi)多發(fā)硬化癥(MS)的動(dòng)物模型。MS是一種由自身免疫反應(yīng)引起的以炎性脫髓鞘為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)退行性疾病,目前困擾著全球超過(guò)250萬(wàn)人的健康。LINGO-1是軸突髓鞘形成的負(fù)調(diào)控因子,具有抑制軸突生長(zhǎng),阻止髓鞘再生,促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元凋亡的作用。在抗炎治療的基礎(chǔ)上,神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植被認(rèn)為可能是治療該病的一種有效途徑。目標(biāo)本研究從胎鼠海馬中分離NSCs,通過(guò)分子生物學(xué)手段將其改造成穩(wěn)定過(guò)表達(dá)分泌型LINGO-1拮抗劑LINGO-1-Fc的NSCs,研究NSCs遞送LINGO-1-Fc是否能通過(guò)促進(jìn)髓鞘再生對(duì)EAE小鼠有治療作用。方法雌性C57BL/6小鼠被隨機(jī)分為3組：模型組,GFP-NSCs組,LINGO-1-Fc-NSCs組。在所有實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)MOG35-55主動(dòng)免疫后第23天,LINGO-1-Fc-NSCs組經(jīng)尾靜脈注射1×106個(gè)LINGO-1-Fc-GFP-NSCs (200ul)、GFP-NSCs組注射1×106個(gè)GFP-NSCs (200ul)、模型組注射200ul PBS,每日觀察小鼠行為并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。于免疫后第48天處死,取小鼠脊髓腰骶膨大組織進(jìn)行組織病理學(xué)染色：HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、LFB染色觀察髓鞘脫失、免疫熒光染色檢測(cè)內(nèi)源性和外源性MBP+、GFAP+、NeuN+細(xì)胞數(shù)目,以及小膠質(zhì)／巨噬細(xì)胞的數(shù)目和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)；同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)分析了CNS和脾中CD4+T細(xì)胞亞群的變化。在體外實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用免疫熒光染色研究了LINGO-1-Fc-NSCs培養(yǎng)上清對(duì)OPCs增殖和分化的影響。結(jié)果1.利用慢病毒介導(dǎo)的方法建立了穩(wěn)定表達(dá)LINGO-1-Fc的NSCs細(xì)胞株,LINGO-1-Fc感染后48h,NSCs的LINGO-1-Fc分泌量高達(dá)195.00±9.75ng/106 cells,顯著高于NSCs組和GFP-NSCs組。2.本實(shí)驗(yàn)中,小鼠從免疫后第13天開(kāi)始發(fā)病,至免疫后第19天進(jìn)入高峰期,高峰期維持時(shí)間較長(zhǎng),細(xì)胞移植后13-25天,GFP-NSCs組較模型組顯著降低了神經(jīng)功能評(píng)分(P0.01),而LINGO-1-Fc-NSCs的起效時(shí)間比GFP-NSCs早11天,而且作用效果更加明顯,在細(xì)胞移植后第2天至處死前,LINGO-1-Fc-NSCs組較模型組(P0.001)和GFP-NSCs組(P0.05)均顯著改善了臨床功能評(píng)分,將疾病高峰期縮短至6天。3.HE染色結(jié)果顯示,相對(duì)于模型組(P0.001)和GFP-NSCs組(P0.01),LINGO-1-Fc-NSCs組脊髓“袖套樣”結(jié)構(gòu)明顯減少,外周炎性細(xì)胞浸潤(rùn)面積占脊髓面積的比值顯著降低；LFB染色顯示,LINGO-1-Fc-NSCs組較其他兩組髓鞘脫失比例顯著降低。4.免疫熒光染色結(jié)果：(1) LINGO-1-Fc-NSCs組較模型組(P0.01)和GFP-NSCs組(P0.01)總的MBP熒光強(qiáng)度(MFI)顯著增強(qiáng),LINGO-1-Fc-NSCs組和GFP-NSCs組都有外源性少突膠質(zhì)細(xì)胞(GFP+/MBP+細(xì)胞)分化,但兩組之間差異不顯著；(2) LINGO-1-Fc-NSCs組和GFP-NSCs組均存在外源性神經(jīng)元分化,且LINGO-1-Fc組較GFP-NSCs組外源神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P0.05)；(3)模型組病灶部位出現(xiàn)明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,且伴隨有大量的炎性細(xì)胞聚集,相對(duì)于模型組,GFP-NSCs組和LINGO-1-Fc-NSCs組總的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)數(shù)目和內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+/GFP-)數(shù)目均明顯減少,且LINGO-1-Fc-NSCs組較GFP-NSCs組總的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目(P0.05)和外源性星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+/ GFP+)數(shù)目(P0.001)減少；(4)相對(duì)于模型組,LINGO-1-Fc-NSCs組Iba-1+細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P0.01),而LINGO-1-Fc-NSCs組較GFP-NSCs組Iba-1+細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯變化(P=0.066)；(5)各組小鼠脊髓均有具典型分葉核(多為3葉)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),且主要分布于脊髓白質(zhì),相對(duì)于模型組,GFP-NSCs組(P0.05)和LINGO-1-Fc-NSCs(P0.01)組Gr-1+細(xì)胞數(shù)目均顯著減少；5.流式分析顯示,與模型組相比,LINGO-1-Fc-NSCs組降了低外周CD4+/IL-17+比例(P0.05)。6.體外實(shí)驗(yàn)表明,和GFP-NSCs組相比,LINGO-1-Fc-NSCs培養(yǎng)上清可抑制OPCs增殖,并促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分枝形成,促進(jìn)OPCs向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。結(jié)論1.LINGO-1-Fc-NSCs和GFP-NSCs移植均可緩解EAE病情,但LINGO-1-Fc-NSCs較GFP-NSCs起效時(shí)間更早、作用效果更明顯；2. LINGO-Fc-NSCs具有重要的神經(jīng)修復(fù)作用,移植的LINGO-1-Fc-NSCs主要促進(jìn)內(nèi)源性少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟、促進(jìn)髓鞘修復(fù)和重建、抑制OPCs和內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、抑制外源性星形膠質(zhì)細(xì)胞分化、促進(jìn)外源性神經(jīng)元分化；3.移植的LINGO-1-Fc-NSCs具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能,LINGO-1-Fc-NSCs可抑制外周炎性細(xì)胞浸潤(rùn)C(jī)NS、抑制外周Th17分化、抑制CNS小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞活化。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R744.51

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本文編號(hào)：1242956