本文關(guān)鍵詞：Necrostatin-1對小鼠腦出血模型血腫周圍組織神經(jīng)保護作用研究

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【摘要】：目的研究程序性壞死是否參與腦出血后組織病理損害過程,程序性壞死特殊抑制劑Necrostatin-1對血腫周圍組織的影響,及其與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系。方法①在體實驗：隨機將ICR小鼠分為正常組、假手術(shù)組、腦出血組、Necrostatin-1組和Dmso組。使用Ⅳ型膠原酶左側(cè)基底節(jié)注射1μ1制作腦出血模型,假手術(shù)組注射等量生理鹽水。Necrostatin-1組、Dmso組先在左側(cè)側(cè)腦室分別注射Necrostatin-1、Dmso 1μl預(yù)處理,5mi n后再在基底節(jié)注射膠原酶1μ1。術(shù)后1d、3d、5d、7d取小鼠雙側(cè)紋狀體組織,利用western blot法檢測各組小鼠受體相互作用蛋白酶1(receptor interacting proteinl,RIP1)、受體相互作用蛋白酶3(receptor interacting protein3, RIP3)表達水平變化；采用干濕重法測定術(shù)后24h腦組織含水量的變化；利用血紅蛋白檢測試劑盒檢測術(shù)后24h兩側(cè)大腦半球血紅蛋白含量變化；采用改良Garcia評分、轉(zhuǎn)角實驗、轉(zhuǎn)棒實驗評估小鼠神經(jīng)功能缺損情況；采用組織免疫熒光法觀察術(shù)后3d出血側(cè)血腫周圍組織少突膠質(zhì)細胞變化。②離體實驗：取孕13.5或14.5天的C57/BL6孕鼠子宮中胎鼠皮層細胞,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48-72小時后,按1：2傳代至24孔板,兩天后,分為正常組和紅細胞裂解液組,紅細胞裂解液組加入裂解液10μ1,第三天倒置顯微鏡下觀察紅細胞裂解液對少突膠質(zhì)細胞形態(tài)的影響；將培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞分為正常組、紅細胞裂解液組、Necropstatin-1組和Dmso組,處理1d后,用碘化吡啶(Propidium Iodide, PI)標記壞死細胞并熒光顯微鏡下觀察各組少突膠質(zhì)細胞變化。結(jié)果1在體實驗①出血側(cè)RIP1、RIP3蛋白表達：正常組RIP1蛋白有較低表達,假手術(shù)組較正常組表達量稍高。腦出血組RIP1蛋白表達1d時即明顯升高、3d達到高峰,5d、7d逐漸下降。Necrostatin-1組在相應(yīng)時間點RIP1蛋白表達較正常組、假手術(shù)組高,但低于腦出血組.Dmso組RIP1蛋白表達也很高,高于假手術(shù)組、Necrostatin-1組,與腦出血組比較差異不大。RIP3在相應(yīng)時間點蛋白表達變化與RIP1相同,但表達量沒有RIP1蛋白高。②腦組織含水量：正常組腦組織含水量平均約為72%,假手術(shù)組約為73.1%,與正常組相比,無顯著差異(P0.05)。腦出血組出血側(cè)含水量明顯增多,與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Necrostatin-1組出血側(cè)含水量約為75.5%,與假手術(shù)組比較也是增多的(P0.05),但明顯少于腦出血組(P0.05)。Dmso組出血側(cè)含水量明顯增多,與假手術(shù)組比較差異有差異(P0.05),與腦出血組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。③腦組織血紅蛋白含量：正常組腦組織血紅蛋白含量很低,平均約為0.1μg/m g,假手術(shù)組約為0.35μg/mg,與正常組相比,無顯著差異(P0.05)。腦出血組出血側(cè)血紅蛋白含量明顯增多,與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Necrostatin-1組出血側(cè)血紅蛋白含量約為0.8μg/mg,比假手術(shù)組增高(P0.05),但少于腦出血組(P0.05)。Dmso組出血側(cè)血紅蛋白含量比假手術(shù)組增多(P0.05),但與腦出血組比較無顯著差異(P0.05)。④組織免疫熒光少突膠質(zhì)細胞變化：正常組少突膠質(zhì)細胞死亡數(shù)目很少,腦出血組出血側(cè)血腫周圍組織少突膠質(zhì)細胞大量死亡,與正常組相比,有顯著差異(P0.01)。Necrostatin-1組與腦出血組比較,少突膠質(zhì)細胞死亡減少(P0.05)。Dmso組出血側(cè)少突膠質(zhì)細胞也存在大量死亡,與腦出血組比較無顯著差異(P0.05)。⑤神經(jīng)功能缺損：各組小鼠術(shù)前改良Garcia評分均在20分左右,無顯著差異,術(shù)后1d腦出血組、I)mso組、Necrostatin-1組評分均明顯降低,各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,Necrostatin-1組4d、7d分值升高,與腦出血組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。術(shù)前各組小鼠轉(zhuǎn)角次數(shù)無顯著差異,術(shù)后1d,各組小鼠向損傷側(cè)(左側(cè))轉(zhuǎn)角次數(shù)均增多,4d開始,Necrostatin-1組向損傷側(cè)轉(zhuǎn)角次數(shù)減少,與腦出血組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。術(shù)前各組小鼠在轉(zhuǎn)輪上時間無差異,1d各組小鼠在輪上時間均縮短,各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,2d至7d,Necrostatin-1組在輪上時間延長,與腦出血組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2離體實驗正常組少突膠質(zhì)細胞突起較多、細胞形態(tài)飽滿；加入紅細胞裂解液后細胞突起明顯減少、細胞發(fā)生萎縮。使用PI標記壞死細胞,正常組PI陽性細胞數(shù)量較少,細胞裂解液組則可觀察到大量的PI陽性細胞(P0.01)。Necrostatin-1組PI陽性細胞數(shù)比正常組多(P0.05),但比細胞裂解液組明顯減少(P0.05)。Dmso組也存在大量PI陽性細胞,與正常組比較有顯著差異(P0.01),與細胞裂解液組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論①程序性壞死可能參與了腦出血后組織病理損傷過程,腦出血后出血部位RIP1、RIP3表達升高,Necrostatin-1可降低腦出血后RIP1、RIP3蛋白的表達。②腦出血后出血側(cè)腦組織含水量、血紅蛋白含量增高,Necrostatin-1可降低腦出血后腦組織含水量、血紅蛋白含量。③腦出血后血腫周圍組織少突膠質(zhì)細胞發(fā)生大量死亡,Necrostatin-1可降低腦出血后血腫周圍少突膠質(zhì)細胞壞死數(shù)目,并降低紅細胞裂解液引起的少突膠質(zhì)細胞壞死；紅細胞裂解液可能與腦出血后少突膠質(zhì)細胞程序性壞死有關(guān)。④小鼠腦出血后存在神經(jīng)功能損傷,Necrostatin-1可促進腦出血后小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.34

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