本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tα-突觸核蛋白單克隆SH-SY5Y細胞株的建立

  更多相關(guān)文章： α-突觸核蛋白 真核表達載體pLentiVENUS-SNCA 單克隆SH-SYY細胞株

【摘要】：目的利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含人野生型(WT)及致病突變A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突觸核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重組真核表達載體pLentiVENUS-YFP-SNCA,通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法獲得過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tα-synuclein單克隆SH-SY5Y細胞株。方法提取紅白血病細胞K562細胞總RNA,以RT-PCR法擴增SNCA,SNCA與克隆載體PMD-19T的體外連接(T-A克隆)后進行基因測序,將測序正確者以限制性內(nèi)切酶酶切后與真核表達載體pLentiVENUS連接,建立野生型重組真核表達載體。取正常SNCA與克隆載體連接體,利用單核苷酸差異引物定點突變法構(gòu)建SNCA的兩個突變型A30P、A53T,經(jīng)基因測序、酶切與真核表達載體pLentiVENUS連接,建立突變型的重組真核表達載體。以磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細胞制備的慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,利用流式細胞儀BD AriaⅢ進行96孔板單細胞分選以獲得穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變型A30P、A53Tα-突觸核蛋白的單克隆細胞株,并通過倒置熒光顯微鏡、蛋白免疫印跡、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鑒定各單克隆SHSY5Y細胞株是否過表達。結(jié)果 Rt-PCR及電泳結(jié)果顯示所獲得目的基因,基因測序結(jié)果正確;重組真核表達載體pLentiVENUS-SNCA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序證明構(gòu)建成功。倒置熒光顯微鏡顯示除對照組(未轉(zhuǎn)染組)外,空載體轉(zhuǎn)染組及載體與SNCA重組后轉(zhuǎn)染組均有熒光蛋白表達;但蛋白免疫印跡結(jié)果顯示載體與正常或突變的SNCA重組后轉(zhuǎn)染組的蛋白含量高于空載體組。RT-PCR結(jié)果顯示載體與正�；蛲蛔兊腟NCA重組后轉(zhuǎn)染組的細胞RNA表達量高于空載體組。結(jié)論利用分子克隆技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立過表達α-突觸核蛋白的WT及A53T、A30P突變型SH-SY5Y單克隆細胞株。
【作者單位】： 蘇州大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;蘇州大學醫(yī)學部神經(jīng)生物學教研室;唐仲英血液病學研究中心;
【基金】：蘇州市科技計劃項目基金(基金編號:SYS201103)
【分類號】：R741
【正文快照】： established.The familial PD-linked A53Tand A30P mutation were generated by site-directed gene mutagenesisusing primer difference in mononucleotide on the base of WT SNCA.We confirmed the orientation and sequenceof each construction by restriction analysi

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