本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定過表達(dá)人野生型及致病突變A30P、A53Tα-突觸核蛋白單克隆SH-SY5Y細(xì)胞株的建立

  更多相關(guān)文章： α-突觸核蛋白 真核表達(dá)載體pLentiVENUS-SNCA 單克隆SH-SYY細(xì)胞株

【摘要】：目的利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含人野生型(WT)及致病突變A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突觸核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重組真核表達(dá)載體pLentiVENUS-YFP-SNCA,通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法獲得過表達(dá)人野生型及致病突變A30P、A53Tα-synuclein單克隆SH-SY5Y細(xì)胞株。方法提取紅白血病細(xì)胞K562細(xì)胞總RNA,以RT-PCR法擴(kuò)增SNCA,SNCA與克隆載體PMD-19T的體外連接(T-A克隆)后進(jìn)行基因測(cè)序,將測(cè)序正確者以限制性內(nèi)切酶酶切后與真核表達(dá)載體pLentiVENUS連接,建立野生型重組真核表達(dá)載體。取正常SNCA與克隆載體連接體,利用單核苷酸差異引物定點(diǎn)突變法構(gòu)建SNCA的兩個(gè)突變型A30P、A53T,經(jīng)基因測(cè)序、酶切與真核表達(dá)載體pLentiVENUS連接,建立突變型的重組真核表達(dá)載體。以磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備的慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀BD AriaⅢ進(jìn)行96孔板單細(xì)胞分選以獲得穩(wěn)定過表達(dá)人野生型及致病突變型A30P、A53Tα-突觸核蛋白的單克隆細(xì)胞株,并通過倒置熒光顯微鏡、蛋白免疫印跡、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鑒定各單克隆SHSY5Y細(xì)胞株是否過表達(dá)。結(jié)果 Rt-PCR及電泳結(jié)果顯示所獲得目的基因,基因測(cè)序結(jié)果正確;重組真核表達(dá)載體pLentiVENUS-SNCA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和基因測(cè)序證明構(gòu)建成功。倒置熒光顯微鏡顯示除對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)外,空載體轉(zhuǎn)染組及載體與SNCA重組后轉(zhuǎn)染組均有熒光蛋白表達(dá);但蛋白免疫印跡結(jié)果顯示載體與正�；蛲蛔兊腟NCA重組后轉(zhuǎn)染組的蛋白含量高于空載體組。RT-PCR結(jié)果顯示載體與正�；蛲蛔兊腟NCA重組后轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞RNA表達(dá)量高于空載體組。結(jié)論利用分子克隆技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立過表達(dá)α-突觸核蛋白的WT及A53T、A30P突變型SH-SY5Y單克隆細(xì)胞株。
【作者單位】： 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)教研室;唐仲英血液病學(xué)研究中心;
【基金】：蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目基金(基金編號(hào):SYS201103)
【分類號(hào)】：R741
【正文快照】： established.The familial PD-linked A53Tand A30P mutation were generated by site-directed gene mutagenesisusing primer difference in mononucleotide on the base of WT SNCA.We confirmed the orientation and sequenceof each construction by restriction analysi

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