發(fā)布時間：2017-11-13 23:17

  本文關(guān)鍵詞：山東部分地區(qū)乙型腦炎患者中西尼羅病毒感染情況的研究

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【摘要】：目的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的主要流行區(qū)域是亞洲,我國自1949年于北京分離出第一株JEV而今已累計60余年歷史,目前JEV已成為中國流行最為廣泛的蟲媒病毒之一。世界上第一株西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)于1937年在烏干達(dá)境內(nèi)一名發(fā)熱婦女的血液中被分離出,此后在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,由WNV感染所引起的西尼羅熱(West Nile fever, WNF)已經(jīng)成為全球最嚴(yán)重的蟲媒傳染病之一。2014年,呂志等首次在中國新疆喀什地區(qū)的尖音庫蚊中分離出5株WNV,并在該地區(qū)部分發(fā)熱病人的血清樣本中檢測到WNV中和抗體,表明中國也存在著WNV的流行風(fēng)險。JEV和WNV同屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)、乙型腦炎血清群,二者均可通過庫蚊等媒介傳播,感染后均可引起嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病,二者引起的癥狀在臨床診斷中不容易區(qū)分,目前乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)的診斷通�；贘EV抗體檢測,由于JEV和WNV抗體存在交叉反應(yīng),因此該種方法檢測的結(jié)果很有可能出現(xiàn)WNV感染的誤診。山東省是JE的高發(fā)地區(qū),本研究以2013年山東部分地區(qū)臨床診斷為JE的病人為研究對象,通過病毒分離、RT-PCR和血清抗體檢測的方法,研究該病人中是否存在WNV感染,以及JEV和WNV抗體的交叉反應(yīng)情況,為JEV和WNV感染的診斷和預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。方法1.標(biāo)本來源山東省濟(jì)南市傳染病醫(yī)院2013年9～10月入院的242例病人,根據(jù)《流行性乙型腦炎診斷標(biāo)準(zhǔn)WS214-2008》臨床診斷為JE,共采集急性期血清和腦脊液214份(以入院第一次采集樣本為急性期樣本,包括177份血清和37份腦脊液),恢復(fù)期血清58份,其中30例病人同時有急性期和恢復(fù)期血清。病人來自濱州、德州、菏澤、濟(jì)南、聊城、泰安等地,以濟(jì)南市為主。2.病毒的分離鑒定使用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,1%青鏈霉素混合液)常規(guī)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞,待細(xì)胞長成至單層后,取急性期的血清和腦脊液接種,每隔24 h觀察細(xì)胞病變(CPE),將發(fā)生CPE的標(biāo)本取上清提取RNA,通過巢式RT-PCR擴(kuò)增JEV和WNV的核酸,擴(kuò)增陽性者經(jīng)測序驗(yàn)證后確定是否為JEV或WNV感染；如1w后無CPE出現(xiàn),使用BHK21細(xì)胞繼續(xù)傳3代,每代均提取培養(yǎng)物上清中的RNA進(jìn)行WNV和JEV核酸的檢測。細(xì)胞至傳3代后,WNV或JEV核酸檢測均為陰性的樣本,病毒分離定為陰性。對于出現(xiàn)細(xì)胞CPE,且JEV或WNVRNA檢測證實(shí)為陽性的病例,實(shí)驗(yàn)室確診為JEV或WNV感染。3.病毒RNA的檢測 對急性期的血清和腦脊液分別提取其中的RNA,使用巢式RT-PCR的方法擴(kuò)增JEV和WNV的RNA。對于擴(kuò)增陽性的標(biāo)本,進(jìn)行序列測定證實(shí)為JEV或WNV感染,并用MEGA5.0軟件分析基因序列確定病毒的型別。4.患者血清和腦脊液中抗體的檢測運(yùn)用間接免疫熒光(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法對單份急性期樣本(血清和腦脊液)進(jìn)行JEV-IgM和WNV-IgM檢測；對雙份血清樣本,急性期和恢復(fù)期血清分別進(jìn)行JEV-IgM和WNV-IgM、JEV-IgG和WNV-IgG檢測；對單份恢復(fù)期血清進(jìn)行JEV-IgG和WNV-IgG檢測。IFA中,急性期血清中JEV-IgM、WNV-IgM和恢復(fù)期血清中JEV-IgG、WNV-IgG均從1：32開始稀釋,檢測抗體效價；ELISA法從1：100(急性期)或1：41(恢復(fù)期)開始進(jìn)行倍比稀釋,檢測抗體效價。IFA和ELISA中,均以抗體陽性的最高稀釋度作為抗體效價。對于血清學(xué)檢測結(jié)果為下列兩種情況的視為WNV感染可疑病例：①兩種病毒抗體檢測均陽性樣本：抗體效價WNV-IgM/JEV-IgM≥4或WNV-IgG/JEV-IgG≥4者。②WNV-IgM (+)、JEV-IgM(-)或WNV-IgG (+)、JEV-IgG (-)的樣本。結(jié)果1.病毒的分離鑒定 214份急性期血清和腦脊液中均未分離到JEV或WNV。2.病毒RNA的檢測巢式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,急性期血清中有4例病人JEV RNA的E片段擴(kuò)增結(jié)果為陽性,經(jīng)測序證實(shí)為JEV RNA, JEV RNA陽性率為1.87%(4/214),未擴(kuò)增出WNV RNA的3'非編碼區(qū)的目的片段,MEGA5.0軟件的基因序列分析結(jié)果表明4例患者感染的JEV均為基因Ⅲ型。3.抗體檢測的結(jié)果IFA檢測結(jié)果顯示,無論是急性期還是恢復(fù)期血清,從1：32開始,隨著稀釋度的增加,熒光逐漸變?nèi)?未檢測到抗體效價WNV-IgM/ JEV-IgM≥4或WNV-IgG/JEV-IgG≥4的標(biāo)本。ELISA檢測結(jié)果顯示,急性期樣本中,WNV-IgM (+)的共74份,有3個樣本抗體效價WNV-IgM/JEV-IgM≥4,1個樣本W(wǎng)NV-IgM效價為1：800,而JEV-IgM抗體為(-),為高度可疑病例�；謴�(fù)期樣本中,WNV-IgG和JEV-IgG共同(+)的共18例,其中2例抗體效價WNV-IgG/JEV-IgG≥4,另有9個樣本JEV-IgG(-)、WNV-IgG(+)。根據(jù)WNV-IgM、 WNV-IgG的ELISA效價檢測結(jié)果,JE患者中WNV感染疑似病例為15例。結(jié)論山東省部分地區(qū)2013年臨床確診為JE的患者中,JEV RNA檢測陽性的患者有4名,其血清中擴(kuò)增到JEV RNA E區(qū)的片段,序列分析證實(shí)均為JEV的基因Ⅲ型。根據(jù)血清抗體檢測結(jié)果推測,患者中可能存在WNV感染病例,但由于本次研究因同時具有急性期和恢復(fù)期的雙份血清樣本較少,又無WNV蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)對WNV抗體進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,故不能完全支持山東省存在WNV流行的情況。結(jié)合本次研究結(jié)果和山東地區(qū)存在WNV傳播媒介的情況,提示山東省加強(qiáng)JE防控的同時應(yīng)增加WNV的監(jiān)測。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.3

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