本文關(guān)鍵詞：缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤逆分化為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外研究

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【摘要】：背景和目的:膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)的高度惡性腫瘤,由于侵襲性生長以及對放化療的高度抵抗,使得膠質(zhì)瘤術(shù)后極易復(fù)發(fā),患者預(yù)后極差。近年來,隨著腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)學(xué)說逐漸被證明,研究者認(rèn)為膠質(zhì)瘤的這種惡性進(jìn)展、對放化療的高度抵抗以及術(shù)后短時間內(nèi)的高復(fù)發(fā)現(xiàn)象與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stem cells,GSCs)密切相關(guān)。因此,以膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為靶點的治療方法將成為全新的治療手段。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為一種異常細(xì)胞,具有不斷自我更新及無限增殖能力。然而,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞數(shù)目在膠質(zhì)瘤中含量極少,比例約為10%。如此少量的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖造成腫瘤復(fù)發(fā)將需要很長時間,因此單純依靠膠質(zhì)瘤干細(xì)胞學(xué)說并不能很好解釋上述臨床現(xiàn)象。由于膠質(zhì)瘤的高代謝以及血管的異常紊亂,使得整個膠質(zhì)瘤組織始終處于一個相對缺氧的環(huán)境中,其內(nèi)包含了分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、可溶性因子等。研究表明缺氧微環(huán)境可以加快膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新及增殖速率,但對于分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響目前研究較少。回顧文獻(xiàn),放化療可以促使非乳腺癌干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為乳腺癌干細(xì)胞,而放化療本身即可以造成腫瘤進(jìn)一步缺氧;另有報道顯示未經(jīng)分選的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)可以促使膠質(zhì)瘤干細(xì)胞比例逐漸升高,根據(jù)這些研究,我們推測:缺氧可以誘導(dǎo)分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞逆分化形成膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以形成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,而在缺氧環(huán)境下上述現(xiàn)象更為明顯,這也進(jìn)一步提示缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生逆分化的可能,但由于上述研究局限于腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基自身對分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響,因此仍不能說明單純?nèi)毖跏欠窨梢哉T導(dǎo)分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生逆分化形成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。為證明這一科學(xué)假說,我們擬通過體外實驗,采用單細(xì)胞成球、不對稱分裂檢測、免疫熒光、q RT-PCR、Western-blot等方法予以驗證,并通過細(xì)胞增殖、凋亡、周期等檢測予以輔助證明,從而為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思考方向及治療靶點。實驗方法:第一部分:(1)細(xì)胞分選:采用免疫磁珠分選的方法分選得到CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞群;(2)單細(xì)胞成球:制成單個CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液后于常氧、缺氧培養(yǎng),每日鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并分別予0,3,7,14,21天行圖像采集,統(tǒng)計成球數(shù)目并行數(shù)據(jù)分析;(3)不對稱分裂生長特性檢測:將由單個cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧培養(yǎng)21天后所成懸浮球體分別于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基中培養(yǎng),每日鏡下觀察懸浮球體生長狀態(tài)并分別于1,3,5天行圖像采集;(4)免疫熒光檢測:將單個cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧培養(yǎng)21天后所成懸浮球體及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧培養(yǎng)48小時后固定,通過免疫熒光檢測方法檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)表達(dá)情況;(5)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)rna表達(dá)檢測:磁珠分選后的cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別缺氧培養(yǎng)0,3,6,9,12,24h后行qrt-pcr檢測;(6)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog)蛋白表達(dá)檢測:磁珠分選后的cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別缺氧培養(yǎng)0,12,24,48,72h后行western-blot檢測;(7)cd133+細(xì)胞數(shù)表達(dá)檢測:cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧培養(yǎng)0,3,6,9,12,15d后流式細(xì)胞儀分析cd133+細(xì)胞數(shù)表達(dá)改變情況。第二部分:(1)增殖檢測:cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞行常氧、缺氧培養(yǎng),分別予條件培養(yǎng)1,3,5,7,9,11d行cck-8檢測細(xì)胞增殖;(2)凋亡檢測:cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞行常氧、缺氧培養(yǎng),分別予條件培養(yǎng)后1,3,5,7d行流式細(xì)胞儀凋亡檢測;(3)周期檢測:cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞行常氧、缺氧培養(yǎng),分別予條件培養(yǎng)后1,3,5,7d行流式細(xì)胞儀周期檢測。結(jié)果:(1)缺氧培養(yǎng)單個cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以懸浮成球,而常氧培養(yǎng)不能懸浮成球,即缺氧培養(yǎng)組成球能力高于常氧組(p0.001);(2)缺氧培養(yǎng)單個cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞所成懸浮球體表現(xiàn)出不對稱分裂特性;(3)缺氧培養(yǎng)單個cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞所成懸浮球體高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白;缺氧培養(yǎng)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后同樣高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133);(4)qrt-pcr及western-blot檢測示缺氧培養(yǎng)后,腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)rna水平及蛋白水平均逐漸增高(p0.05);(5)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,其膠質(zhì)瘤干細(xì)胞經(jīng)典標(biāo)記物cd133+細(xì)胞數(shù)比例逐漸升高(p0.05);(6)缺氧培養(yǎng)cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速率顯著高于常氧培養(yǎng)組(p0.001);(7)缺氧培養(yǎng)cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率顯著低于常氧培養(yǎng)組(p0.05);(8)缺氧培養(yǎng)cd133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯于g0/g1期,且隨著缺氧時間的延長,g0/g1期細(xì)胞數(shù)比例逐漸增多(p0.05);結(jié)論:缺氧可以誘導(dǎo)分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生逆分化形成膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞,形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為成球樣懸浮生長,生物學(xué)上表現(xiàn)為高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記蛋白,并呈現(xiàn)為快增殖、低凋亡及周期阻滯特性。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 Zhao Peng;Chen-Xiao Wang;Er-Hu Fang;Guo-Bin Wang;Qiang Tong;;Role of epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer initiation and progression[J];World Journal of Gastroenterology;2014年18期

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本文編號：1177982