本文關(guān)鍵詞：內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的作用

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【摘要】：圍產(chǎn)期窒息所致缺氧缺血性(hypoxic-ischemic,HI)腦損傷,是導(dǎo)致新生兒死亡和慢性殘障的主要原因。全球每年用于HI腦病治療和護(hù)理的費(fèi)用給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。由于新生兒大腦的不同部位對(duì)HI損傷呈選擇性,針對(duì)特定易損神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞群的治療機(jī)會(huì)非常有限。探索HI腦損傷確切機(jī)制并尋找有效治療方案,是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一。研究表明,谷氨酸作用與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性和氧化應(yīng)激在HI腦損傷中扮演重要角色,我們前期在HI腦損傷動(dòng)物模型中也證實(shí)了這一點(diǎn)。在成年腦缺血模型中,興奮毒性和氧化損傷,可直接或間接激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1),催化合成大量死亡分子聚腺苷二磷酸核糖(Poly ADP-ribose,PAR)聚合物,誘導(dǎo)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)進(jìn)入細(xì)胞核,導(dǎo)致PARP1依賴性細(xì)胞死亡(Parthanatos)的發(fā)生。新近發(fā)現(xiàn)的NMDA受體誘導(dǎo)產(chǎn)生的存活蛋白Iduna,是一種內(nèi)源性PAR/AIF死亡通路抑制劑,可通過(guò)特異性結(jié)合PAR,干擾AIF核轉(zhuǎn)位,從而抑制谷氨酸及其NMDA受體興奮毒性介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上調(diào)Iduna的表達(dá)水平,能夠抑制PAR信號(hào)介導(dǎo)的Parthanatos,從而對(duì)NMDA受體興奮毒性引起的腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。那么Iduna蛋白在新生鼠中的表達(dá)與定位是怎樣的情況?新生鼠HI腦損傷過(guò)程中是否同樣存在由PAR介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞Parthanatos死亡呢?而Iduna表達(dá)與AIF的關(guān)系如何?在原代神經(jīng)元細(xì)胞中上調(diào)Iduna后,是否會(huì)降低氧糖剝奪(OGD)對(duì)細(xì)胞造成的損傷呢?本研究主要有三個(gè)部分,實(shí)驗(yàn)一擬研究以新生大鼠為對(duì)象,觀察Iduna在腦組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)二擬研究新生大鼠HI腦損傷過(guò)程中,大腦皮層損傷與Iduna的關(guān)系,以及Iduna表達(dá)與AIF的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)三擬構(gòu)建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,觀察原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna上調(diào)后細(xì)胞損傷情況。第一部分內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位目的明確內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達(dá)水平及其細(xì)胞定位。方法取SD新生鼠各器官組織,采用Western-blot評(píng)價(jià)Iduna蛋白表達(dá)的組織特異性。制作SD新生鼠腦組織石蠟與冰凍切片,通過(guò)免疫組織化學(xué)觀察Iduna蛋白在新生鼠腦組織的表達(dá)水平及定位特點(diǎn),免疫熒光三標(biāo)腦組織冰凍切片確認(rèn)Iduna在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位。培養(yǎng)原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,Real-time PCR定量分析Iduna在兩種神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。在原代神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞中通過(guò)免疫熒光雙染Neu N和GFAP驗(yàn)證Iduna的細(xì)胞定位。結(jié)果Western-blot結(jié)果提示新生鼠肺組織中Iduna表達(dá)水平最高,其次為腦和脊髓組織;腦組織免疫組化染色顯示Iduna主要表達(dá)在皮層和海馬區(qū)域;大腦海馬免疫熒光三標(biāo)提示Iduna主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿內(nèi)(79.85%),原代神經(jīng)細(xì)胞的免疫熒光三染也驗(yàn)證了這一結(jié)果(80.6%);RT-PCR證實(shí)Iduna在神經(jīng)元中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于星形膠質(zhì)細(xì)胞(P0.001)。結(jié)論1、內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠各器官中的表達(dá)具有組織特異性,腦組織是Iduna高表達(dá)的臟器。2、腦組織中Iduna主要分布在海馬及皮層區(qū)域。3、海馬區(qū)和皮層區(qū)域Iduna均主要定位于神經(jīng)元胞漿中,提示其可能與神經(jīng)元的功能有關(guān)。第二部分新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna和AIF表達(dá)的相關(guān)性目的觀察7日齡大鼠缺氧缺血性腦損失后腦皮層中Iduna與AIF表達(dá)的變化及相關(guān)性。方法96只新生大鼠被分為假手術(shù)組,缺氧1h和缺氧2h三組。在缺氧缺血性腦損傷24h后,通過(guò)HE染色、尼氏染色、透射電鏡、TUNEL染色和免疫熒光法來(lái)評(píng)估HI對(duì)新生鼠大腦皮層神經(jīng)元存活數(shù)量的影響。免疫組化分析HI對(duì)皮層組織Iduna表達(dá)與DNA損傷的影響。用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡分析來(lái)檢測(cè)HI對(duì)新生大鼠皮層Iduna表達(dá)水平與核內(nèi)AIF含量的影響。并在HI腦損傷1個(gè)月時(shí)通過(guò)Morris水迷宮評(píng)估大鼠遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)和記憶能力。結(jié)果與假手術(shù)組比較,HI腦損傷后大腦皮層結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)元存活數(shù)量減少、細(xì)胞亞細(xì)胞器(線粒體)結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞DNA斷裂加劇。且缺氧2h比缺氧1h大鼠的腦損傷更加嚴(yán)重。另外,當(dāng)Iduna表達(dá)明顯減少時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的AIF表達(dá)增加。缺氧2h后Iduna表達(dá)下降并與核內(nèi)AIF表達(dá)呈負(fù)相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.950,P0.0001)。缺氧后的大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)和記憶能力均下降。結(jié)論1、新生鼠缺氧缺血性腦損傷進(jìn)程中,大腦皮層組織損傷嚴(yán)重、神經(jīng)存活數(shù)量減少、神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重。2、伴隨缺氧缺血時(shí)長(zhǎng)的增加,皮層組織中內(nèi)源性存活蛋白Iduna含量顯著下降,同時(shí)胞核內(nèi)AIF的含量顯著增多。3、出生早期的缺氧缺血損傷能夠顯著影響大鼠遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶能力。第三部分細(xì)胞水平觀察上調(diào)Iduna對(duì)缺氧神經(jīng)元損傷的影響目的構(gòu)建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(PCDH-Iduna),包裝Iduna過(guò)表達(dá)慢病毒,以期上調(diào)原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna的表達(dá)。觀察Iduna上調(diào)后對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪后細(xì)胞活性的影響。方法提取SD大鼠腦組織總RNA,利用RT-PCR的方法獲取大鼠Iduna c DNA序列,將其插入慢病毒過(guò)表達(dá)載體PCDH質(zhì)粒中,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。將PCDH-Iduna(以PCDH-EGFP為陰性對(duì)照)及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,包裝Iduna過(guò)表達(dá)慢病毒,顯微鏡下觀察HEK293T細(xì)胞的形態(tài)變化,了解病毒包裝情況。用慢病毒感染原代神經(jīng)元細(xì)胞,Western blot檢測(cè)靶細(xì)胞中Iduna的表達(dá)效率。待Iduna上調(diào)后,進(jìn)行氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)并采用MTT法、LDH和彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳顯示Iduna的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1068 bp左右片段,酶切鑒定可見(jiàn)有約1000bp左右片段釋放,且測(cè)序結(jié)果提示克隆正確。將Iduna過(guò)表達(dá)慢病毒表達(dá)載體PCDH-Iduna及包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出毒時(shí)特有的致細(xì)胞病變效應(yīng)。Iduna過(guò)表達(dá)慢病毒及其對(duì)照病毒感染原代神經(jīng)元細(xì)胞,免疫熒光及Western-blot檢測(cè)提示病毒感染的神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna表達(dá)增加。MTT檢測(cè)顯示,氧糖剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞存活率顯著下降(P0.01),而Iduna過(guò)表達(dá)后可顯著抵抗氧糖剝奪引起的神經(jīng)元細(xì)胞存活率下降(P0.5)。LDH漏出率檢測(cè),氧糖剝奪可使神經(jīng)元乳酸脫氫酶漏出率增加(P0.001),而Iduna過(guò)表達(dá)后可減少氧糖剝奪引起的乳酸脫氫酶漏出(P0.5)。彗星實(shí)驗(yàn)得出上調(diào)Iduna可以減少OGD對(duì)神經(jīng)元DNA完整性的損傷。結(jié)論1、成功構(gòu)建了慢病毒過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。2、包裝獲得了具有良好感染效率的Iduna過(guò)表達(dá)慢病毒,顯著上調(diào)了原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna的表達(dá)水平。3、上調(diào)Iduna的表達(dá)可顯著抑制OGD引起的神經(jīng)元損傷(如改善細(xì)胞狀態(tài)、抵抗神經(jīng)元死亡、保護(hù)細(xì)胞完整性以及減少DNA斷裂)。
【關(guān)鍵詞】：Iduna蛋白 蛋白表達(dá) 定位 新生鼠 神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞 Iduna AIF 缺氧缺血性腦損傷 新生大鼠 Iduna 重組質(zhì)粒 慢病毒 感染 氧糖剝奪
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742
【目錄】：

• 摘要4-8
• abstract8-11
• 符號(hào)說(shuō)明11-13
• 第一部分 內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位13-27
• 前言13
• 材料方法13-21
• 結(jié)果21-24
• 討論24-26
• 結(jié)論26-27
• 第二部分 新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna和AIF表達(dá)的相關(guān)性27-41
• 前言27-28
• 材料與方法28-33
• 結(jié)果33-38
• 討論38-40
• 結(jié)論40-41
• 第三部分 細(xì)胞水平觀察上調(diào)Iduna對(duì)缺氧神經(jīng)元損傷的影響41-57
• 前言41
• 材料與方法41-49
• 結(jié)果49-54
• 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 綜述60-74
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76

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本文編號(hào)：1103670