本文關(guān)鍵詞：內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的作用

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【摘要】：圍產(chǎn)期窒息所致缺氧缺血性(hypoxic-ischemic,HI)腦損傷,是導(dǎo)致新生兒死亡和慢性殘障的主要原因。全球每年用于HI腦病治療和護理的費用給社會、家庭和個人帶來沉重負擔。由于新生兒大腦的不同部位對HI損傷呈選擇性,針對特定易損神經(jīng)系統(tǒng)和細胞群的治療機會非常有限。探索HI腦損傷確切機制并尋找有效治療方案,是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一。研究表明,谷氨酸作用與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性和氧化應(yīng)激在HI腦損傷中扮演重要角色,我們前期在HI腦損傷動物模型中也證實了這一點。在成年腦缺血模型中,興奮毒性和氧化損傷,可直接或間接激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1),催化合成大量死亡分子聚腺苷二磷酸核糖(Poly ADP-ribose,PAR)聚合物,誘導(dǎo)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)進入細胞核,導(dǎo)致PARP1依賴性細胞死亡(Parthanatos)的發(fā)生。新近發(fā)現(xiàn)的NMDA受體誘導(dǎo)產(chǎn)生的存活蛋白Iduna,是一種內(nèi)源性PAR/AIF死亡通路抑制劑,可通過特異性結(jié)合PAR,干擾AIF核轉(zhuǎn)位,從而抑制谷氨酸及其NMDA受體興奮毒性介導(dǎo)的細胞死亡。上調(diào)Iduna的表達水平,能夠抑制PAR信號介導(dǎo)的Parthanatos,從而對NMDA受體興奮毒性引起的腦損傷產(chǎn)生保護作用。那么Iduna蛋白在新生鼠中的表達與定位是怎樣的情況?新生鼠HI腦損傷過程中是否同樣存在由PAR介導(dǎo)的神經(jīng)元細胞Parthanatos死亡呢?而Iduna表達與AIF的關(guān)系如何?在原代神經(jīng)元細胞中上調(diào)Iduna后,是否會降低氧糖剝奪(OGD)對細胞造成的損傷呢?本研究主要有三個部分,實驗一擬研究以新生大鼠為對象,觀察Iduna在腦組織中的表達及細胞定位。實驗二擬研究新生大鼠HI腦損傷過程中,大腦皮層損傷與Iduna的關(guān)系,以及Iduna表達與AIF的關(guān)系。實驗三擬構(gòu)建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表達質(zhì)粒,觀察原代神經(jīng)元細胞中Iduna上調(diào)后細胞損傷情況。第一部分內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達及細胞定位目的明確內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達水平及其細胞定位。方法取SD新生鼠各器官組織,采用Western-blot評價Iduna蛋白表達的組織特異性。制作SD新生鼠腦組織石蠟與冰凍切片,通過免疫組織化學(xué)觀察Iduna蛋白在新生鼠腦組織的表達水平及定位特點,免疫熒光三標腦組織冰凍切片確認Iduna在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中的定位。培養(yǎng)原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞,Real-time PCR定量分析Iduna在兩種神經(jīng)細胞中的表達水平。在原代神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞中通過免疫熒光雙染Neu N和GFAP驗證Iduna的細胞定位。結(jié)果Western-blot結(jié)果提示新生鼠肺組織中Iduna表達水平最高,其次為腦和脊髓組織;腦組織免疫組化染色顯示Iduna主要表達在皮層和海馬區(qū)域;大腦海馬免疫熒光三標提示Iduna主要表達于神經(jīng)元細胞的胞漿內(nèi)(79.85%),原代神經(jīng)細胞的免疫熒光三染也驗證了這一結(jié)果(80.6%);RT-PCR證實Iduna在神經(jīng)元中的表達豐度遠遠高于星形膠質(zhì)細胞(P0.001)。結(jié)論1、內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠各器官中的表達具有組織特異性,腦組織是Iduna高表達的臟器。2、腦組織中Iduna主要分布在海馬及皮層區(qū)域。3、海馬區(qū)和皮層區(qū)域Iduna均主要定位于神經(jīng)元胞漿中,提示其可能與神經(jīng)元的功能有關(guān)。第二部分新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna和AIF表達的相關(guān)性目的觀察7日齡大鼠缺氧缺血性腦損失后腦皮層中Iduna與AIF表達的變化及相關(guān)性。方法96只新生大鼠被分為假手術(shù)組,缺氧1h和缺氧2h三組。在缺氧缺血性腦損傷24h后,通過HE染色、尼氏染色、透射電鏡、TUNEL染色和免疫熒光法來評估HI對新生鼠大腦皮層神經(jīng)元存活數(shù)量的影響。免疫組化分析HI對皮層組織Iduna表達與DNA損傷的影響。用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡分析來檢測HI對新生大鼠皮層Iduna表達水平與核內(nèi)AIF含量的影響。并在HI腦損傷1個月時通過Morris水迷宮評估大鼠遠期的學(xué)習(xí)和記憶能力。結(jié)果與假手術(shù)組比較,HI腦損傷后大腦皮層結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)元存活數(shù)量減少、細胞亞細胞器(線粒體)結(jié)構(gòu)破壞以及細胞DNA斷裂加劇。且缺氧2h比缺氧1h大鼠的腦損傷更加嚴重。另外,當Iduna表達明顯減少時細胞核內(nèi)的AIF表達增加。缺氧2h后Iduna表達下降并與核內(nèi)AIF表達呈負相關(guān),有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.950,P0.0001)。缺氧后的大鼠遠期學(xué)習(xí)和記憶能力均下降。結(jié)論1、新生鼠缺氧缺血性腦損傷進程中,大腦皮層組織損傷嚴重、神經(jīng)存活數(shù)量減少、神經(jīng)細胞DNA損傷嚴重。2、伴隨缺氧缺血時長的增加,皮層組織中內(nèi)源性存活蛋白Iduna含量顯著下降,同時胞核內(nèi)AIF的含量顯著增多。3、出生早期的缺氧缺血損傷能夠顯著影響大鼠遠期的學(xué)習(xí)記憶能力。第三部分細胞水平觀察上調(diào)Iduna對缺氧神經(jīng)元損傷的影響目的構(gòu)建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表達質(zhì)粒(PCDH-Iduna),包裝Iduna過表達慢病毒,以期上調(diào)原代神經(jīng)元細胞中Iduna的表達。觀察Iduna上調(diào)后對神經(jīng)元細胞氧糖剝奪后細胞活性的影響。方法提取SD大鼠腦組織總RNA,利用RT-PCR的方法獲取大鼠Iduna c DNA序列,將其插入慢病毒過表達載體PCDH質(zhì)粒中,經(jīng)酶切和測序驗證重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。將PCDH-Iduna(以PCDH-EGFP為陰性對照)及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,包裝Iduna過表達慢病毒,顯微鏡下觀察HEK293T細胞的形態(tài)變化,了解病毒包裝情況。用慢病毒感染原代神經(jīng)元細胞,Western blot檢測靶細胞中Iduna的表達效率。待Iduna上調(diào)后,進行氧糖剝奪實驗并采用MTT法、LDH和彗星實驗檢測細胞活性。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳顯示Iduna的PCR擴增產(chǎn)物大小為1068 bp左右片段,酶切鑒定可見有約1000bp左右片段釋放,且測序結(jié)果提示克隆正確。將Iduna過表達慢病毒表達載體PCDH-Iduna及包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,鏡下可見細胞呈現(xiàn)出毒時特有的致細胞病變效應(yīng)。Iduna過表達慢病毒及其對照病毒感染原代神經(jīng)元細胞,免疫熒光及Western-blot檢測提示病毒感染的神經(jīng)元細胞中Iduna表達增加。MTT檢測顯示,氧糖剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)元細胞存活率顯著下降(P0.01),而Iduna過表達后可顯著抵抗氧糖剝奪引起的神經(jīng)元細胞存活率下降(P0.5)。LDH漏出率檢測,氧糖剝奪可使神經(jīng)元乳酸脫氫酶漏出率增加(P0.001),而Iduna過表達后可減少氧糖剝奪引起的乳酸脫氫酶漏出(P0.5)。彗星實驗得出上調(diào)Iduna可以減少OGD對神經(jīng)元DNA完整性的損傷。結(jié)論1、成功構(gòu)建了慢病毒過表達重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。2、包裝獲得了具有良好感染效率的Iduna過表達慢病毒,顯著上調(diào)了原代神經(jīng)元細胞中Iduna的表達水平。3、上調(diào)Iduna的表達可顯著抑制OGD引起的神經(jīng)元損傷(如改善細胞狀態(tài)、抵抗神經(jīng)元死亡、保護細胞完整性以及減少DNA斷裂)。
【關(guān)鍵詞】：Iduna蛋白 蛋白表達 定位 新生鼠 神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞 Iduna AIF 缺氧缺血性腦損傷 新生大鼠 Iduna 重組質(zhì)粒 慢病毒 感染 氧糖剝奪
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742
【目錄】：

• 摘要4-8
• abstract8-11
• 符號說明11-13
• 第一部分 內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達及細胞定位13-27
• 前言13
• 材料方法13-21
• 結(jié)果21-24
• 討論24-26
• 結(jié)論26-27
• 第二部分 新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna和AIF表達的相關(guān)性27-41
• 前言27-28
• 材料與方法28-33
• 結(jié)果33-38
• 討論38-40
• 結(jié)論40-41
• 第三部分 細胞水平觀察上調(diào)Iduna對缺氧神經(jīng)元損傷的影響41-57
• 前言41
• 材料與方法41-49
• 結(jié)果49-54
• 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-60
• 綜述60-74
• 參考文獻68-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75-76
• 個人簡歷76

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本文編號：1103670