發(fā)布時間：2017-10-23 04:28

  本文關(guān)鍵詞：MEF2D在活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達及作用

  更多相關(guān)文章： MEF2D IL-10 小膠質(zhì)細胞 神經(jīng)炎癥 帕金森病

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病,在60歲以上老人中,其發(fā)病率達到了1%[1],該病不僅嚴重影響了病人的身心健康,而且給家庭及社會都會造成巨大的負擔。PD表現(xiàn)為慢性進展病程,臨床表現(xiàn)多樣,其中靜止性震顫是PD的典型表現(xiàn)。PD的病理表現(xiàn)主要是中腦黑質(zhì)致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺能神經(jīng)元缺失,從而引起紋狀體內(nèi)多巴胺含量顯著減少,最終導致發(fā)病[2]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫固有細胞,其在監(jiān)視大腦內(nèi)損傷及病原體侵入方面發(fā)揮重要的免疫學作用,同時在維護神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。小膠質(zhì)細胞在中腦SNc區(qū)密度明顯高于其他腦區(qū),細胞動物實驗以及PD病人尸檢腦片均已證明了小膠質(zhì)細胞在PD發(fā)病過程中起了重要作用,因此小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應被認為是多巴胺能神經(jīng)元的丟失、PD發(fā)病的重要原因之一。肌細胞增強因子(Myocyte enhancer factor,MEF2)作為機體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,其廣泛表達于各種細胞,如骨骼肌細胞、心肌細胞,免疫細胞及神經(jīng)元等,通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮重要的作用。近年來,不斷的研究表明,MEF2在PD病人中,對于多巴胺能神經(jīng)元的保護具有重要作用。此外,已有研究顯示在外周T細胞中可以檢測到MEF2D表達,并且MEF2D參與炎癥反應的調(diào)節(jié)過程。但是,對于MEF2D在小膠質(zhì)細胞中是否表達,以及其在小膠質(zhì)細胞中的主要作用的研究,目前國內(nèi)外還沒有這方面的報道。目的本實驗主要研究轉(zhuǎn)錄因子MEF2D在腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況、MEF2D轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因,以及在小膠質(zhì)細胞活化時,MEF2D在炎癥反應中的調(diào)節(jié)作用與相關(guān)機制及其對多巴胺能神經(jīng)元存活的影響。方法首先,觀察活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D的表達水平。通過腹腔注射MPTP,建立C57小鼠急性PD模型,制作SNc區(qū)腦組織切片,使用免疫熒光染色觀察小膠質(zhì)細胞內(nèi)的MEF2D水平。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2細胞系及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞,通過q PCR及免疫印跡檢測技術(shù),觀察不同時間點下MEF2D的m RNA水平及蛋白水平表達情況,然后利用EMSA方法檢測MEF2D的活性變化。其次,探索LPS刺激條件下BV2細胞系內(nèi)MEF2D的功能作用。通過q PCR及ELISA實驗方法檢測LPS刺激條件下BV2內(nèi)的炎癥因子TNF-α的表達水平及抗炎因子IL-10的表達水平。通過Ch IP技術(shù)檢測MEF2D與IL-10基因啟動子區(qū)結(jié)合的情況。利用含有能特異性干擾MEF2D的sh RNA的重組慢病毒感染BV2,檢測LPS刺激BV2細胞條件下,細胞內(nèi)IL-10及TNF-α的表達情況。利用BV2細胞的培養(yǎng)上清建立小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)模型,通過MTT及TUNEL實驗檢測不同實驗條件下,共培養(yǎng)中的神經(jīng)元存活情況。結(jié)果實驗一:中腦黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D的表達變化。通過建立急性PD模型,可以看到受到刺激后活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D表達水平明顯升高,同時SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元死亡增加。使用LPS刺激BV2細胞及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞,可以看到,在受到LPS刺激24小時后,原代細胞內(nèi)的MEF2D表達水平明顯升高,而在BV2細胞內(nèi),LPS刺激18小時后MEF2D的m RNA水平及蛋白水平均開始升高。使用EMSA技術(shù)可以檢測到LPS刺激24小時后,BV2內(nèi)的MEF2D蛋白活性水平也是升高的。實驗二:活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D調(diào)控的靶基因的研究。檢測LPS刺激條件下,BV2的TNF-α及IL-10的表達,可以看到TNF-α表達水平在2小時達到最高,而IL-10的表達從刺激后18小時開始升高,且其升高趨勢和MEF2D的變化是相符合的。Ch IP實驗顯示,IL-10是MEF2D調(diào)節(jié)的下游因子。使用慢病毒干擾BV2內(nèi)MEF2D的表達,免疫印跡實驗檢測干擾效率符合實驗要求。干擾MEF2D后,LPS刺激后BV2內(nèi)IL-10的表達水平及分泌水平均顯著降低,而TNF-α的m RNA表達水平明顯升高。實驗三:活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D對于多巴胺能神經(jīng)元存活的影響用培養(yǎng)BV2細胞的上清液培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元細胞系SN4741細胞,建立共培養(yǎng)模型。干擾BV2細胞內(nèi)MEF2D的表達或者利用IL-10中和抗體阻斷IL-10的功能,均能夠提高LPS刺激后BV2細胞培養(yǎng)上清液的神經(jīng)元毒性,誘導更多的神經(jīng)元凋亡。結(jié)論我們的研究首次揭示了MEF2D在小膠質(zhì)細胞內(nèi)表達,其表達水平在小膠質(zhì)細胞活化后明顯升高,升高的MEF2D同時伴隨著神經(jīng)炎癥因子的表達降低及抗炎因子的表達升高,通過分子生物學及細胞生物學方法我們發(fā)現(xiàn)MEF2D直接調(diào)控了抗炎因子IL-10的表達。從而闡明了一個全新的小膠質(zhì)細胞活化后炎癥的發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)過程:小膠質(zhì)細胞活化引起了MEF2D水平的升高,MEF2D調(diào)節(jié)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄過程,從而使其表達及分泌增多,升高的抑炎因子抑制了小膠質(zhì)細胞分泌炎性因子,明確了MEF2D可決定小膠質(zhì)細胞M1和M2表型轉(zhuǎn)化、改變微環(huán)境、調(diào)節(jié)神經(jīng)元應激反應,為PD的治療提供了新的研究靶點。
【關(guān)鍵詞】：MEF2D IL-10 小膠質(zhì)細胞 神經(jīng)炎癥 帕金森病
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻回顧14-25
• 實驗一 中腦黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D的表達變化25-44
• 1 材料25-27
• 2 方法27-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 實驗二 活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D調(diào)控的靶基因的研究44-56
• 1 材料44-46
• 2 方法46-51
• 3 結(jié)果51-55
• 4 討論55-56
• 實驗三 活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D對于多巴胺能神經(jīng)元存活的影響56-61
• 1 材料56-57
• 2 方法57-58
• 3 結(jié)果58-60
• 4 討論60-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻62-78
• 個人簡歷和研究成果78-79
• 致謝79-80

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 杜一星,王偉;小膠質(zhì)細胞的活化與調(diào)控[J];國外醫(yī)學(腦血管疾病分冊);2004年08期

2 李小媚;李愛萍;;小膠質(zhì)細胞的發(fā)育和功能[J];解剖學研究;2010年03期

3 楊逢春;顯示小膠質(zhì)細胞方法的改進[J];解剖學研究;2002年02期

4 袁瓊蘭,郭勇,王瓊,鄧莉,高小青,余鴻,古元;小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)、分離、純化和鑒定的初步研究[J];瀘州醫(yī)學院學報;2002年05期

5 劉鋒,朱長庚;小膠質(zhì)細胞激活的分子機制[J];解剖科學進展;2003年02期

6 蔣平,彭艷,倪健,向正華,焦炳華;小膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)組三維分離方法的建立[J];第二軍醫(yī)大學學報;2005年06期

7 熊懷林,范光碧,胡興宇;小膠質(zhì)細胞在腦缺血中的作用[J];四川解剖學雜志;2005年02期

8 魏桂榮,張敏,董繼華,梅元武,劉仁剛;構(gòu)建一種高產(chǎn)量小膠質(zhì)細胞體外純化培養(yǎng)的方法(英文)[J];中國臨床康復;2005年21期

9 趙洋;孫素真;;小膠質(zhì)細胞和癲癇[J];中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志;2008年01期

10 王均輝;孫峰波;秦綠葉;岳鑫;于常海;;異常活化的小膠質(zhì)細胞的特征與功能[J];生理科學進展;2008年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韓書珍;李雪梅;牛文澤;陳翔;王果;李澤宜;;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察大鼠局灶性腦缺血半暗區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞的變化及意義[A];第六屆江浙滬兒科學術(shù)會議暨兒科學基礎(chǔ)與臨床研究進展學術(shù)班論文匯編[C];2009年

2 李捷;劉勇;張蓬勃;肖新莉;呂海俠;李敏杰;康前雁;鄧美英;;大鼠局灶性腦缺血后小膠質(zhì)細胞的來源[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

3 賈思遠;雷露雯;王克萬;王勇;;煙堿型乙酰膽堿受體在離體海馬小膠質(zhì)細胞上的表達與定位[A];廣東省藥學會2009學術(shù)年會論文集[C];2010年

4 劉鋒;朱長庚;劉慶瑩;;小膠質(zhì)細胞的激活及其在致癇過程中的作用機制[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

5 趙天智;;血清白蛋白刺激小膠質(zhì)細胞前炎癥細胞因子表達的作用研究[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

6 趙敏;袁云;趙培園;李t，

本文編號：1081627