本文關(guān)鍵詞：MLIF在腦缺血中的神經(jīng)保護作用及其機制研究

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【摘要】：研究目的:腦卒中,主要由缺血性腦卒中和出血性腦卒中組成,其中87%的腦卒中患者為缺血性腦卒中。腦卒中一直以其高致殘率和高死亡率嚴(yán)重威脅著世界人民的健康。大量研究表明腦卒中發(fā)病機制錯綜復(fù)雜,涉及炎癥、凋亡、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激等多種環(huán)節(jié),其中腦缺血引起的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死是引起腦卒中患者腦細(xì)胞死亡,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織病變的重要機制。因此,尋找具有抗炎和抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的防治藥物具有深遠(yuǎn)的科學(xué)價值和重要的社會意義。單核細(xì)胞遷移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor;MLIF),是一種具有熱穩(wěn)定性的五肽。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)MLIF可以顯著降低大鼠、小鼠腦缺血模型的腦梗死面積,并發(fā)現(xiàn)MLIF可以與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b End3細(xì)胞)中真核翻譯延長因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1 A1,e EF1A1)結(jié)合,作用于e NOS的3’-UTR來上調(diào)e NOS蛋白的表達(dá),進(jìn)而降低粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)水平,發(fā)揮對腦缺血的保護作用。為進(jìn)一步探討MLIF的腦缺血保護作用機制,本課題擬進(jìn)一步在神經(jīng)細(xì)胞和整體動物水平研究MLIF的神經(jīng)保護作用及其機制,為腦卒中的預(yù)防和治療提供新的研究思路。研究方法與結(jié)果:1.我們分別運用氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)和缺氧缺糖復(fù)氧(OGD/R)的方法建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y體外缺氧/復(fù)氧模型,分別采用MTT實驗,LDH實驗,流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258染色方法檢測MLIF對氧糖剝奪后SH-SY5Y細(xì)胞的生存率和凋亡率的影響。結(jié)果顯示我們建立的OGD模型成功誘導(dǎo)了細(xì)胞的損傷,并確定缺氧6h為較佳缺氧時間;MTT實驗結(jié)果顯示MLIF可以顯著升高OGD以及OGD/R后細(xì)胞的生存率(P0.01);LDH實驗結(jié)果顯示,MLIF可以顯著改善OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258染色實驗結(jié)果顯示,MLIF可以顯著改善由于OGD以及OGD/R引起的細(xì)胞的凋亡和壞死(P0.01)。2.我們運用western blot實驗檢測MLIF對OGD后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)在OGD后的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi),p-JNK、p-p38、p-ERK、p53、cleaved caspase3、cleaved caspase9凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.01 or P0.05),給予MLIF處理后,相比于模型組,p-JNK、p53、cleaved caspase3和cleaved caspase9蛋白的表達(dá)顯著降低(P0.01 or P0.05),p-p38和p-ERK的表達(dá)未發(fā)生顯著變化。以上結(jié)果表明,MLIF可以通過抑制p-JNK/p53凋亡通路來抑制OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。3.利用pull-down實驗尋找MLIF在大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白。通過蛋白之間的pull-down實驗,及SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色,發(fā)現(xiàn)MLIF的結(jié)合蛋白分子量約為50KDa,取特異性蛋白條帶進(jìn)行酶解結(jié)合質(zhì)譜鑒定找出MLIF在細(xì)胞中的特異性結(jié)合蛋白,比對數(shù)據(jù)庫中肽段匹配數(shù)并對比分子量,確定50KDa的蛋白e EF1A2(eukaryotic translation elongation factor 1A2)為MLIF在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白。我們運用western blot的方法在原代神經(jīng)元細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞上做了進(jìn)一步驗證。為了進(jìn)一步驗證MLIF與該靶點蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合,我們運用免疫熒光技術(shù)采用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)FITC-MLIF與e EF1A2在SH-SY5Y細(xì)胞的胞漿內(nèi)存在共定位。以上結(jié)果表明MLIF在神經(jīng)細(xì)胞中特異性結(jié)合的蛋白為e EF1A2。4.利用siRNA技術(shù),在SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染e EF1A2 siRNA,檢測MLIF對OGD誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護作用。MTT實驗結(jié)果顯示,相對于NC陰性對照組,e EF1A2基因干擾組細(xì)胞生存率顯著降低(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞的凋亡,結(jié)果顯示相比于NC陰性對照組細(xì)胞凋亡率,e EF1A2基因干擾組細(xì)胞凋亡率顯著升高,細(xì)胞核固縮嚴(yán)重,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,e EF1A2基因干擾后MLIF抑制凋亡蛋白p-JNK/p53的作用減弱(P0.05)。5.利用大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法制作大鼠腦缺血再灌注模型,研究MLIF對于腦缺血動物模型的神經(jīng)保護作用及其機制。實驗分為假手術(shù)組、模型組和MLIF組,尼氏染色檢測手術(shù)后7天,14天和28天大腦皮層和海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài),用相應(yīng)的檢測試劑盒檢測手術(shù)后7周動物血清內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和MDA以及炎癥因子IL-1β和TNF-α的變化,Morris水迷宮實驗檢測各組動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化;結(jié)果顯示,MLIF可以改善大鼠腦缺血后大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài),并提高動物的記憶能力,升高SOD的含量,降低MDA和炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量。結(jié)論:1.MLIF可以顯著提高氧糖剝奪后SH-SY5Y細(xì)胞的生存率,抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死。2.MLIF在SH-SY5Y細(xì)胞中與e EF1A2相結(jié)合,抑制p-JNK/p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而減少OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.MLIF可以通過減少大鼠缺血再灌注恢復(fù)期大腦皮層和海馬神經(jīng)元損傷,并改善腦缺血再灌注導(dǎo)致的記憶損傷,升高SOD含量清除氧自由基,降低MDA含量抗脂質(zhì)過氧化,降低炎癥因子IL-1β、TNF-α水平來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【關(guān)鍵詞】：氧糖剝奪 神經(jīng)保護 單核細(xì)胞遷移抑制因子(MLIF) 真核細(xì)胞翻譯延長因子(eEF1A2) 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-15
• 前言15-18
• 第一部分 MLIF對神經(jīng)細(xì)胞氧糖剝奪損傷的作用研究18-29
• 一、實驗材料與方法18-21
• （一）實驗材料18-19
• （二）實驗方法19-21
• 二、實驗結(jié)果21-27
• （一）MLIF提高OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞生存率21-23
• （二）MLIF 降低 OGD 誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡23-26
• （三）MLIF增加OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞生存率并抑制細(xì)胞凋亡26-27
• 三、討論27-29
• 第二部分 MLIF的抗OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用機制研究29-59
• 一、實驗材料和方法29-42
• （一）實驗材料29-32
• （二）實驗方法32-42
• 二、實驗結(jié)果42-54
• （一） MLIF對OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)caspase相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的影響42-43
• （二） MLIF對OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響43-44
• （三） MLIF對OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p38和ERK蛋白表達(dá)水平的影響44-45
• （四）MLIF對OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)的影響45-46
• （五）神經(jīng)細(xì)胞中MLIF特異性結(jié)合蛋白46-50
• （六）eEF1A2 RNA干擾對MLIF的神經(jīng)保護作用的影響50-54
• 三、討論54-59
• 第三部分 MLIF對于大鼠腦缺血后的神經(jīng)保護作用研究59-69
• 一、實驗材料與方法59-62
• （一）實驗材料59-60
• （二）實驗方法60-62
• 二、實驗結(jié)果62-67
• （一）MLIF對腦缺血后大鼠神經(jīng)元的影響62-65
• （二）MLIF對腦缺血后大鼠記憶能力的影響65
• （三）MLIF對腦缺血后大鼠血清中SOD和MDA的影響65-66
• （四） MLIF對缺血后大鼠血清內(nèi)炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的影響66-67
• 三、討論67-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 綜述 eEF1A2的非經(jīng)典作用研究進(jìn)展77-83
• 1. eEF1A2結(jié)構(gòu)與經(jīng)典作用77-78
• 2. eEF1A2與腫瘤78
• 3. eEF1A2與凋亡78-79
• 4. eEF1A2與神經(jīng)系統(tǒng)79-80
• 5. 總結(jié)80
• 參考文獻(xiàn)80-83
• 在讀期間發(fā)表論文和科研工作情況說明83-84
• 致謝84-85

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