發(fā)布時間：2017-10-20 01:38

  本文關(guān)鍵詞：在癲癇神經(jīng)元中miR-132調(diào)控BDNF-TrkB信號通路表達的研究

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【摘要】：目的:顳葉癲癇是最常見的癲癇類型,且絕大多數(shù)是藥物難治性癲癇,其發(fā)病機制尚不十分清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)促進了神經(jīng)元的存活、生長發(fā)育及分化等過程。其生物學(xué)功能主要通過特異性受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B,Trk B)介導(dǎo)而實現(xiàn)。近來研究表明BDNF-Trk B信號通路在癲癇的發(fā)生與發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。微小RNA(micro RNA)是一種內(nèi)源性非編碼蛋白的小分子RNA�，F(xiàn)已被證實其在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現(xiàn)mi R-132在癲癇發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用,但具體機制有待研究。本課題旨在通過檢測轉(zhuǎn)染mi R-132后的海馬神經(jīng)元癲癇模型中Trk B蛋白磷酸化水平的變化,來了解其對BDNF-Trk B信號通路的調(diào)控作用,并探討其在癲癇發(fā)病中的作用。方法:制備mi R-132慢病毒表達載體。采用24小時內(nèi)新生Sprague Dawley(SD)大鼠,取海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)7天。采用完全隨機化方法將細胞分為①正常組、②癲癇組、③正常+BDNF組、④癲癇+BDNF組、⑤正常+mi R-132組、⑥癲癇+mi R-132組、⑦正常+BDNF+mi R-132組、⑧癲癇+BDNF+mi R-132組。利用膜片鉗技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元放電情況,熒光定量PCR法檢測海馬神經(jīng)元中mi R-132的表達情況,利用免疫印跡技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元中Trk B和p-Trk B蛋白的表達情況,Quantity one軟件對Trk B及p-Trk B的灰度值進行分析,p-Trk B與Trk B的比值表示BDNF-Trk B通路的激活狀態(tài)。方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析,檢驗水準a=0.05,數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行分析,p≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。癲癇模型的制備方法是:細胞培養(yǎng)至第7d時,用“無鎂”細胞外液處理3h,建立大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型。轉(zhuǎn)染mi R-132組的處理方法是:培養(yǎng)至第7d時加入mi R-132慢病毒稀釋液,24h后換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。加入BDNF組的處理方法是:于提取蛋白前10min在培養(yǎng)液中加入BDNF。結(jié)果:1、膜片鉗技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元癇樣放電:與正常組相比,體外培養(yǎng)7d后的癲癇模型組大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)性放電頻率明顯增加(p=0.001)。2、熒光定量PCR法檢測mi R-132表達示:與正常組相比,癲癇組mi R-132表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)。3、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:⑴與癲癇組相比,正常組p-Trk B/Trk B值較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.008);⑵與正常組和相比,正常+BDNF組p-Trk B/Trk B值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.015);⑶與癲癇組相比,癲癇+BDNF組p-Trk B/Trk B值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.012);⑷與癲癇+mi R-132組相比,癲癇組p-Trk B/Trk B值較高(p=0.004),癲癇+BDNF+mi R-132組p-Trk B/Trk B值較高(p=0.030)。4、結(jié)果提示:加入外源性BDNF后,正常組和癲癇組的p-Trk B/Trk B值均明顯升高。說明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路,而加入mi R-132后,癲癇組和癲癇+BDNF組的p-Trk B/Trk B值均有所降低結(jié)論:1.癲癇狀態(tài)下,海馬神經(jīng)元mi R-132表達增高。2.加入外源性BDNF后,正常組和癲癇組的p-Trk B/Trk B值均明顯升高。說明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路。3.正常組比癲癇組的p-Trk B/Trk B值高,說明BDNF-TrkB信號通路在癲癇狀態(tài)下處于受抑制狀態(tài)。4.癲癇神經(jīng)元轉(zhuǎn)染mi R-132后,p-Trk B/Trk B值均有所下降,說明海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染mi R-132后,抑制了BDNF-Trk B信號通路。
【關(guān)鍵詞】：癲癇 海馬 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 酪氨酸激酶B 微小RNA-132 免疫蛋白印跡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1 對象和方法14-30
• 1.1 研究對象14
• 1.2 主要試劑及設(shè)備14-18
• 1.2.1 實驗試劑14-15
• 1.2.2 實驗設(shè)備15-16
• 1.2.3 主要溶液及試劑配方16-18
• 1.3 實驗方法18-29
• 1.3.1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)18
• 1.3.2 海馬神經(jīng)元癲癇模型的建立18-19
• 1.3.3 構(gòu)建miR-132慢病毒表達載體19-25
• 1.3.4 實驗分組25
• 1.3.5 熒光定量PCR法檢測正常組及癲癇組中mi R-132的表達25-26
• 1.3.6 總蛋白的提取及總蛋白濃度測定26-27
• 1.3.7 免疫印跡法檢測蛋白27-29
• 1.4 統(tǒng)計學(xué)分析29-30
• 2 結(jié)果30-36
• 2.1 正常組及癲癇組miR-132表達情況30-31
• 2.2 膜片鉗技術(shù)鑒定細胞癇樣放電結(jié)果31-32
• 2.3 建立miR-132慢病毒表達載體結(jié)果32-33
• 2.4 Westem Blot實驗結(jié)果33-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-45
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明45-46
• 綜述 MicroRNA在癲癇疾病中的調(diào)控作用46-54
• 綜述參考文獻50-54
• 致謝54

【共引文獻】

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本文編號：1064552