本文關(guān)鍵詞：低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖及向多巴胺能神經(jīng)元分化的研究

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【摘要】：目的：研究低氧微環(huán)境是否能促進(jìn)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(OM-MSCs)增殖和低氧微環(huán)境下利用嗅鞘細(xì)胞(OECs)上清液誘導(dǎo)OM-MSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化及其相關(guān)的機(jī)制。方法：1. OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定：分離培養(yǎng)OM-MSCs和OECs,應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)、Western Blot及免疫熒光方法對兩種細(xì)胞分別進(jìn)行鑒定。2. OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖：實驗將含10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的OM-MSCs分成三組：3% O2+YC-1 (HIF-1α抑制劑)組、3%O2組、21%O2組(常氧組),共同培養(yǎng)72h后先對細(xì)胞核進(jìn)行免疫熒光染色、細(xì)胞流式檢測細(xì)胞增殖及凋亡情況,再應(yīng)用Western blot方法檢測各組增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的情況。3. OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導(dǎo)其分化：實驗將OM-MSCs分為另外三組：3%O2+YC-1+OECs上清誘導(dǎo)組(低氧A組)、3%O2+OECs上清誘導(dǎo)組(低氧B組)及21%O2+OECs上清誘導(dǎo)組(常氧對照組),用免疫熒光檢測分化后的多巴胺能神經(jīng)元,用Q-PCR及Western blot分別檢測各組mRNA及蛋白表達(dá)情況,最后用膜片鉗檢測分化的神經(jīng)元離子通道開放情況及ELISA檢測分化后細(xì)胞上清中多巴胺的含量。結(jié)果：1. OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定：分離培養(yǎng)出了OM-MSCs和OECs,并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測出OM-MSCs的純度達(dá)99%；對培養(yǎng)的OECs用免疫熒光進(jìn)行鑒定,能表達(dá)OECs標(biāo)記物P75,又經(jīng)Western Blot對OECs進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定顯示：GFAP和P75均有表達(dá)。2. OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖及凋亡檢測結(jié)果顯示：3%O2組比21%02組的增值系數(shù)(PI)大,且兩組間的細(xì)胞存活及凋亡比例無顯著差異；3%02組OM-MSCs核染色明顯比其他兩組比例要高,且21%O2組的細(xì)胞核數(shù)量最少；Western blot檢測顯示3%02組的PCNA蛋白表達(dá)顯著增高,同樣21%O2組的表達(dá)最少。3. OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導(dǎo)分化檢測結(jié)果顯示：低氧B組OM-MSCs經(jīng)OECs誘導(dǎo)后免疫熒光βⅢ-tubulin表達(dá)最多,且表達(dá)TH神經(jīng)元(多巴胺能神經(jīng)元)；Q-PCR顯示低氧B組HIF-1α及下游靶基因TH表達(dá)明顯增高(P0.05); Western blot表明B組中β III-tubulin和TH蛋白表達(dá)顯著增多,而GFAP蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)；另外,誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元經(jīng)膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)鉀離子電流,且ELISA檢測結(jié)果顯示低氧B組中分泌的多巴胺濃度顯著增加(P0.05)。結(jié)論：低氧微環(huán)境能促進(jìn)OM-MSCs的增殖且對其細(xì)胞活性無影響；低氧微環(huán)境下培養(yǎng)的OM-MSCs經(jīng)OECs上清液誘導(dǎo)后能顯著提高其向神經(jīng)元分化的比例及向多巴胺能神經(jīng)元分化的比例,明顯降低了向膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力,且低氧微環(huán)境下分化的細(xì)胞能分泌更高濃度的多巴胺,此過程與OM-MSCs內(nèi)HIF-1信號通路被激活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：低氧微環(huán)境 嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞 嗅鞘細(xì)胞 低氧誘導(dǎo)因子 多巴胺能神經(jīng)元
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-12
• 前言12-14
• 第一章 材料14-17
• 1 實驗室所需的嗅黏膜來源和實驗操作的地點14
• 2 主要試劑14-15
• 3 主要實驗儀器15
• 4 培養(yǎng)液和基礎(chǔ)試劑的配制15-17
• 4.1 胎牛血清的分裝15-16
• 4.2 DMEM/F12培養(yǎng)基的配制16
• 4.3 常規(guī)的OM-MSCs培養(yǎng)液配制16
• 4.4 無菌PBS平衡鹽溶液配制16
• 4.5 0.25%胰蛋白酶的配制16-17
• 第二章 方法17-27
• 1 OM-MSCs及OECs的取材和培養(yǎng)17
• 2 OM-MSCs的傳代17-18
• 3 細(xì)胞的凍存于復(fù)蘇18
• 4 OM-MSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞周期及凋亡18-19
• 5 低氧微環(huán)境下OECs上清液誘導(dǎo)OM-MSCs的方法及實驗分組19
• 6 細(xì)胞免疫熒光19
• 7 采用免疫熒光PCR檢測各實驗組的目的基因表達(dá)情況19-22
• 7.1 提取組織總RNA19-21
• 7.2 RNA反轉(zhuǎn)錄21
• 7.3 Q-qPCR21-22
• 8 用Western-blot分別檢測各實驗組的蛋白表達(dá)情況22-24
• 8.1 樣品制備22
• 8.2 蛋白濃度檢測22-23
• 8.3 western blot23-24
• 9 用膜片鉗檢測分化后神經(jīng)元離子通道開放情況24-25
• 10 酶聯(lián)免疫吸附實驗操作步驟25-26
• 11 統(tǒng)計學(xué)處理26-27
• 第三章 結(jié)果27-37
• 1 OM-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物流式鑒定分析27
• 2 OM-MSCs、OECs的免疫熒光、Western blot鑒定27-28
• 3 低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖及凋亡的結(jié)果28-31
• 4 誘導(dǎo)OM-MSCs分化后神經(jīng)元光學(xué)顯微鏡下結(jié)果31
• 5 誘導(dǎo)OM-MSCs分化后神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果31-32
• 6 低氧微環(huán)境對神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的影響32-33
• 7 低氧微環(huán)境對HIF-1α及其下游靶基因TH表達(dá)的影響33-35
• 7.1 擴(kuò)增曲線33-34
• 7.2 熔解曲線34-35
• 7.3 Q-PCR相對表達(dá)量如下35
• 8 低氧微環(huán)境下誘導(dǎo)OM-MSCs分化的神經(jīng)元電生理特性檢測35-36
• 9 ELISA檢測誘導(dǎo)分化后各組細(xì)胞分泌多巴胺濃度的差異36-37
• 第四章 討論37-41
• 1 帕金森疾病是目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題之一37
• 2 OM-MSCs的生物學(xué)特性37-38
• 3 低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖與分化及其相關(guān)的研究結(jié)果38-39
• 4 MAPK介導(dǎo)HIF-1信號通路在促進(jìn)MSCs增殖、分化中的作用39-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 主要縮寫詞表54-55
• 在讀期間發(fā)表的主要學(xué)術(shù)論文及參與課題55-56
• 致謝56-57

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本文編號：1002245