本文關(guān)鍵詞：ANGPTL4在糖尿病腎病中的作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的糖尿病腎病以早期持續(xù)增加的微量白蛋白尿和晚期進(jìn)行性腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的下降為主要特征。研究發(fā)現(xiàn)控制蛋白尿的排泄與腎臟的預(yù)后有著緊密的聯(lián)系,而足細(xì)胞損傷在糖尿病患者蛋白尿發(fā)生中起到重要作用。因而,以足細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行糖尿病腎病研究具有特殊意義。血管生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like protein,ANGPTL4)是隸屬于血管生成調(diào)節(jié)蛋白超家族的一種分泌蛋白,在氧化代謝、血管發(fā)生、細(xì)胞分化及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn),在足細(xì)胞相關(guān)腎病中,腎小球足細(xì)胞分泌的ANGPTL4增加;此外,ANGPTL4轉(zhuǎn)基因大鼠表現(xiàn)為足細(xì)胞受損并且產(chǎn)生蛋白尿,提示ANGPTL4可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生腎小球病變并且導(dǎo)致蛋白尿。然而,ANGPTL4對(duì)足細(xì)胞的具體損傷表現(xiàn)及其進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白尿的具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探討,在高糖情況下,ANGPTL4對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架及其功能調(diào)控中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制,并為以ANGPTL4為靶點(diǎn),研究糖尿病腎病預(yù)防和治療的有效途徑和新的藥物靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn):STZ尾靜脈注射誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型,12周時(shí)選取正常對(duì)照組大鼠(10只),DM組大鼠(5只),檢測(cè)血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白,并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察高糖下腎小球病理學(xué)改變,免疫熒光染色觀察ANGPTL4在腎小球中的定位,western blotting檢測(cè)腎臟ANGPTL4及相關(guān)蛋白表達(dá)改變。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)足細(xì)胞同步化后分成:正常糖濃度組(5.6mmol/L葡萄糖),高糖濃度組(30 mmol/L葡萄糖),繼續(xù)觀察培養(yǎng)48h后,應(yīng)用鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記細(xì)胞骨架,觀察高葡萄糖濃度對(duì)人足細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響。并且收集蛋白及RNA,q PCR檢測(cè)足細(xì)胞ANGPTL4表達(dá)改變,western blotting檢測(cè)人足細(xì)胞ANGPTL4及相關(guān)蛋白表達(dá)改變。(2)高糖刺激時(shí)間梯度,檢測(cè)高糖狀態(tài)下人足細(xì)胞系A(chǔ)NGPTL4蛋白表達(dá)及分泌隨時(shí)間的變化。(3)應(yīng)用人重組ANGPTL4蛋白對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行孵育,PI/Hoechst及caspase 3檢測(cè)選取ANGPTL4適宜濃度。足細(xì)胞同步化后予以對(duì)照抗體及ANGPTL4或整合素α3β1中和抗體處理2h后,予以人Angptl4重組蛋白100ng/ml,Western blotting檢測(cè)ANGPTL4、caspase3蛋白表達(dá)改變,鬼筆環(huán)肽染色觀察ANGPTL4蛋白對(duì)人足細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響。研究結(jié)果動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)SD大鼠一般資料顯示,糖尿病組的血糖、24小時(shí)尿白蛋白均較對(duì)照組顯著增加(P0.001),腎重/體重也明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。(2)HE染色結(jié)果顯示,2型糖尿病腎病大鼠腎小球體積增大,系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,腎小球毛細(xì)血管袢呈分葉狀。免疫組化顯示,糖尿病組大鼠腎小球的纖維連接蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。電鏡顯示糖尿病組大鼠腎小球足突排列較為紊亂,有足突融合或者足突脫落現(xiàn)象,與正常對(duì)照組大鼠相比較,其腎小球基底膜顯著性的增厚(P0.05)。(3)免疫熒光染色顯示糖尿病組腎小球區(qū)域WT-1及Synaptopodin的熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組顯著降低。在糖尿病組腎小球WT-1陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少,Synaptopodin陽(yáng)性區(qū)域缺損,提示足細(xì)胞受到損傷。(4)免疫熒光染色顯示ANGPTL4在腎小球足細(xì)胞中有表達(dá),糖尿病組大鼠腎小球ANGPTL4熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組顯著升高(P0.05)。Western blotting檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比較,糖尿病大鼠腎臟ANGPTL4蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05),FAK、MAPK激活。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)人足細(xì)胞在30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48h后,可見細(xì)胞內(nèi)ANGPTL4 mRNA表達(dá)增加(P0.05),ANGPTL4蛋白表達(dá)下降(P0.05),足細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞骨架受損。(2)高糖分別刺激足細(xì)胞6h、12h、24h、48h和72h,在24h內(nèi),足細(xì)胞表達(dá)ANGPTL4蛋白隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P0.05),當(dāng)刺激時(shí)間大于24h時(shí),足細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的ANGPTL4蛋白含量明顯降低(P0.05),此時(shí)足細(xì)胞分泌的ANGPTL4明顯增加(P0.05)。(3)人重組ANGPTL4蛋白0、10、50、100和1000ng/ml孵育人足細(xì)胞,隨ANGPTL4蛋白濃度增加,足細(xì)胞凋亡百分比增加(P0.05),凋亡蛋白active caspase3/pro-caspase 3比值增加(P〈0.05)。人重組ANGPTL4蛋白100ng/ml時(shí),對(duì)足細(xì)胞的作用與葡萄糖30mmol/L相當(dāng)。(4)采用ANGPTL4中和抗體可以降低active caspase 3/pro-caspase 3比值,改善高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞細(xì)胞骨架損傷(P〈0.05);采用整合素α3β1中和抗體可以降低active caspase 3/pro-caspase 3比值,改善人重組ANGPTL4蛋白導(dǎo)致的足細(xì)胞細(xì)胞骨架損傷(P〈0.05)。研究結(jié)論(1)糖尿病大鼠腎臟存在足細(xì)胞損傷,ANGPTL4表達(dá)上調(diào);高糖狀態(tài)下,足細(xì)胞ANGPTL4表達(dá)上調(diào),足細(xì)胞細(xì)胞骨架受損,足細(xì)胞凋亡增加。(2)高糖通過(guò)ANGPTL4發(fā)揮致足細(xì)胞細(xì)胞骨架損傷及足細(xì)胞凋亡的作用。(3)ANGPTL4通過(guò)整合素與足細(xì)胞發(fā)揮作用。以ANGPTL4和整合素α3β1中和抗體可以拮抗高糖對(duì)足細(xì)胞的作用,可以以此為靶點(diǎn)研究新的糖尿病腎病治療藥物。
【關(guān)鍵詞】：ANGPTL4 糖尿病腎病 足細(xì)胞 蛋白尿
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-14
• 引言14-19
• 參考文獻(xiàn)16-19
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法19-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-50
• 討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 全文結(jié)論57-58
• 英文縮略詞表58-60
• 致謝60-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文62

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7 姜e

本文編號(hào)：451512