本文關(guān)鍵詞：晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)足細(xì)胞自噬軸的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景隨著時(shí)代的快速發(fā)展人類(lèi)社會(huì)生活水平不斷提高,糖尿病的患病率在發(fā)展中國(guó)家的增長(zhǎng)速度快速提高。在腎臟疾病領(lǐng)域,隨之而來(lái)的是一大人類(lèi)健康殺手-糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)呈逐年上升的趨勢(shì)不斷增加,現(xiàn)如今全世界范圍內(nèi)約50%的終末期腎衰竭(End-stage renal disease, ESRD)患者來(lái)源于DN,是構(gòu)成ESRD重要的組成部分。較之20世紀(jì),目前越來(lái)越多的患者需要腎臟替代治療來(lái)維持生命,為區(qū)域經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此,及早干預(yù)、延緩DN的進(jìn)展顯得尤為重要。DN是糖尿病全身微血管并發(fā)癥中常見(jiàn)且重要的并發(fā)癥之一。在中國(guó)DN是除原發(fā)性腎小球腎炎夕ESRD的最主要組成部分,是糖尿病患者死亡的重要病因。然而,目前針對(duì)DN的治療遠(yuǎn)達(dá)不到理想水平,DN的進(jìn)展仍不能被很好的控制。其主要原因來(lái)源于對(duì)DN發(fā)病機(jī)制了解的不夠深入,缺乏針對(duì)DN發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的干預(yù)措施來(lái)指導(dǎo)臨床治療。由此可見(jiàn),DN發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)臨床制定干預(yù)措施、延緩DN進(jìn)展具有重要意義。研究表明DN引起的腎損傷主要在腎小球。。腎小球發(fā)揮濾過(guò)功能的關(guān)鍵在于腎小球?yàn)V過(guò)膜,腎小球?yàn)V過(guò)膜主要由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足細(xì)胞組成。其中,足細(xì)胞在維持腎小球?yàn)V過(guò)膜功能中的關(guān)鍵作用已被闡明,足細(xì)胞病更是歸為一類(lèi)重要的腎臟疾病。大量研究表明,足細(xì)胞損傷與DN的發(fā)生發(fā)展存在因果關(guān)系,是DN引起腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)是DN進(jìn)展中一個(gè)關(guān)鍵致病因子,在介導(dǎo)DN足細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用。然而,AGEs介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的具體機(jī)制至今尚未明確。近期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor of advanced glycation end products, RAGE)的活化可通過(guò)提高細(xì)胞自噬水平抵御化療藥物的療效。AGEs是RAGE的重要配體,且RAGE在正常機(jī)體足細(xì)胞中活性水平低,在DN疾病狀態(tài)下足細(xì)胞RAGE活性增強(qiáng)。那么在AGEs介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的過(guò)程中,足細(xì)胞自噬水平會(huì)出現(xiàn)何種改變?這種改變又將發(fā)揮何種作用呢?自噬是生物體依賴(lài)溶酶體對(duì)自身大分子蛋白以及受損細(xì)胞器進(jìn)行自我降解的生理活動(dòng),在維持生物體正常功能以及抵御外界刺激中發(fā)揮著重要作用。自噬可分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。通常意義上所指的自噬為大自噬,本文所研究的對(duì)象也為大自噬(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為自噬)。2010年Hartleben等發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞自噬水平較腎小球其他細(xì)胞明顯活躍,該發(fā)現(xiàn)符合足細(xì)胞終末分化期細(xì)胞的特殊性。同時(shí)Hartleben等闡明：雖然先天性足細(xì)胞自噬缺陷的小鼠可發(fā)育為正常小鼠,但隨年齡的增長(zhǎng)足細(xì)胞自噬缺陷小鼠對(duì)自身穩(wěn)態(tài)的維持明顯劣于正常小鼠,且對(duì)腎小球疾病的易感性明顯大于正常小鼠�？梢�(jiàn),足細(xì)胞高自噬水平在足細(xì)胞正常功能的維持中不可或缺�，F(xiàn)目前研究表明自噬的發(fā)生為一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,包含自噬體形成階段、自噬體與溶媒體融合形成自噬溶酶體階段及自噬溶酶體降解階段,并被理解為自噬軸,其過(guò)程中任一階段發(fā)生障礙均可阻斷自噬軸。因此,更為準(zhǔn)確的探討自噬軸活性的方法不僅是從靜態(tài)的角度去研究而更需以動(dòng)態(tài)變化的視角去觀察。在自噬研究中,最受矚目的明星分子為微管相關(guān)蛋白輕鏈3 II(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)。LC3Ⅱ由胞漿型LC3I轉(zhuǎn)化而來(lái),位于自噬體膜,是自噬體的重要標(biāo)記蛋白,現(xiàn)階段觀察LC3 II的動(dòng)態(tài)變化及水平是研究自噬軸的基本方法和策略。在自噬軸的調(diào)控中涉及一個(gè)重要的信號(hào)通路-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1 (Mammalian target of rapamycincomplex 1, mTORC1)信號(hào)通路,是自噬軸活性水平調(diào)節(jié)過(guò)程中重要的負(fù)調(diào)控機(jī)制。目前有研究報(bào)道,DN疾病狀態(tài)下腎小球足細(xì)胞mTORC1活性顯著增強(qiáng)且在DN的疾病發(fā)生中發(fā)揮有重要作用。那么,如果AGEs可引起足細(xì)胞自噬軸活性水平改變,這種變化是否與足細(xì)胞mTORC1活性狀態(tài)相關(guān)呢?本研究擬從動(dòng)態(tài)的角度來(lái)深入探討AGEs對(duì)足細(xì)胞自噬軸活性的影響,探討可能的分子機(jī)制并研究AGEs導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷與自噬軸活性改變之間的聯(lián)系。從而為DN未來(lái)的治療策略提供新的線索。研究方法一、糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end products-modified bovine serum albumin, AGE-BSA)的制各及純化(一) AGE-BSA的制備采用0.2MPBS配置含有40 mg/mL BSA與90 mg/mL葡萄糖溶液,采用0.22um的過(guò)濾器過(guò)濾除菌后在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育90天。對(duì)照BSA(co-BSA)不加葡萄糖,余處理同上。(二) AGE-BSA的純化AGE-BSA與co-BSA孵育結(jié)束后置換出0.2 M PBS并去除未結(jié)合的剩余葡萄糖。檢測(cè)新制備AGE-BSA的內(nèi)毒素和糖基化水平后采用BCA法測(cè)定其濃度。二、小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及處理分組(一)小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)條件永生化足細(xì)胞系(MPC)復(fù)蘇后用含10%FBS的RPMI-1640 和 20-100U/mL重組小鼠γ干擾素在5%C02,33℃環(huán)境下誘導(dǎo)傳代增殖。然后轉(zhuǎn)入5%C02,37℃培養(yǎng)箱,在37℃培養(yǎng)箱中用不含重組小鼠γ干擾素的RPMI-1640加5%FBS在包被有I型鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)分化。經(jīng)8-12 d的培養(yǎng)誘導(dǎo),足細(xì)胞進(jìn)入分化階段并最終分化成熟。(二)小鼠足細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定將33℃培養(yǎng)箱及37℃培養(yǎng)箱中的足細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下拍片,并觀察比較兩者之間的形態(tài)學(xué)差異；采用足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin染色確定足細(xì)胞是否已分化成熟,成熟足細(xì)胞表達(dá)并延細(xì)胞骨架分布。本實(shí)驗(yàn)所有足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。(三)成熟足細(xì)胞的處理分組(1) AGE-BSA足細(xì)胞損傷模型的建立(2)足細(xì)胞自噬體生成活性動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法構(gòu)建(3) AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞自噬活性的影響(4) AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞mTORC1活性的影響及其與足細(xì)胞受損自噬軸聯(lián)系。三、檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)足細(xì)胞活動(dòng)性；Podocin、LC3Ⅱ、P62的蛋白水平；mTORC1的活性水平；自噬體數(shù)目變化。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。方差齊采用LSD-t法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。如總體比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較。雙側(cè)P0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果一、AGE-BSA足細(xì)胞損傷模型的建立(一) Western blot檢測(cè)AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Podocin的表達(dá)水平的影響足細(xì)胞分化成熟后將足細(xì)胞分為對(duì)照組、co-BSA組、AGE-BSA組。干預(yù)結(jié)束后采用Western blot檢測(cè)podocin的蛋白水平。結(jié)果顯示AGE-BSA組較對(duì)照組Podocin蛋白水平明顯降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,co-BSA組與對(duì)照組相比差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(二)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞移動(dòng)性的影響足細(xì)胞培養(yǎng)成熟后分別通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述分組對(duì)足細(xì)胞移動(dòng)性的影響。結(jié)果顯示AGE-BSA組較對(duì)照組發(fā)生遷移的足細(xì)胞數(shù)目明顯增多且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,co-BSA組與對(duì)照組相比差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。二、建立足細(xì)胞自噬體生成活性動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法(一) Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)氯喹處理后足細(xì)胞LC3Ⅱ及P62蛋白水平足細(xì)胞培養(yǎng)成熟后將足細(xì)胞分為氯喹0h組、氯喹2h組、氯喹4h組、氯喹6h組,處理結(jié)束后采用Western blot檢測(cè)白噬體標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ。兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氯喹(10μM)干預(yù)足細(xì)胞后LC3Ⅱ表達(dá)水平均明顯升高且呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間依賴(lài)性。采用同樣的方法檢測(cè)P62的蛋白水平,隨著氯喹(10μM)干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),P62蛋白水平逐漸升高,也呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性,兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。(二)激光共聚焦顯微鏡及電鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)氯喹處理后足細(xì)胞自噬體數(shù)目改變足細(xì)胞分化成熟后采用一定量的mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足細(xì)胞,24h后給予氯喹干預(yù)0h、2h、4h、6h,細(xì)胞固定后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察不同干預(yù)下足細(xì)胞自噬體數(shù)目(自噬體呈現(xiàn)黃色,自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色)。氯喹Oh組、氯喹2h組、氯喹4h組、氯喹6h組兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨氯喹干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)自噬體數(shù)目不斷累積。分化成熟足細(xì)胞給予氯喹相應(yīng)處理后收集各處理組細(xì)胞,于電鏡下觀察各處理組足細(xì)胞自噬體數(shù)目。電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)隨著氯喹干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),足細(xì)胞自噬體的數(shù)目逐漸增加(電鏡只用來(lái)定性,因此未行統(tǒng)計(jì)分析)。三、AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞自噬活性的影響(一) AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白分子LC3Ⅱ、P62蛋白水平的影響足細(xì)胞分化成熟后分為對(duì)照組、co-BSA組、AGE-BSA組,干預(yù)72h后采用Western blot檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ的蛋白水平。AGE-BSA組較control組LC3Ⅱ蛋白水平明顯降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, co-BSA組與對(duì)照組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣采用Western blot檢測(cè)自噬軸活性相關(guān)蛋白P62的蛋白水平。AGE-BSA組較對(duì)照組P62蛋白水平明顯上調(diào)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,co-BSA組與對(duì)照組相比差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(二) AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞自噬體數(shù)目的影響mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足細(xì)胞,按上述處理干預(yù)足細(xì)胞后觀察足細(xì)胞自噬體。AGE-BSA組較對(duì)照組自噬體數(shù)目明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。co-BSA組與對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(三) AGE-BSA抑制足細(xì)胞白噬體生成活性將分化成熟足細(xì)胞分為對(duì)照組、氯喹2h組、氯喹4h組、氯喹6h組、co-BSA組、co-BSA+氯喹2h組、co-BSA+氯喹4h組、co-BSA+氯喹6h組、AGE-BSA組、AGE-BSA+氯喹2h組、AGE-BSA+氯喹4h組、AGE-BSA+氯喹6h組。干預(yù)結(jié)束后采用Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ。AGE-BSA氯喹干預(yù)系列組較對(duì)照氯喹干預(yù)系列組LC3Ⅱ蛋白水平具有明顯下調(diào)趨勢(shì),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。co-BSA加入氯喹干預(yù)組與對(duì)照氯喹干預(yù)組LC3Ⅱ蛋白水平無(wú)明顯差異。四、AGE-BSA對(duì)足細(xì)胞mTORC1活性的影響及其與足細(xì)胞受損自噬軸聯(lián)系(一) AGE-BSA對(duì)mTORC1活性的影響mTORC1活性通過(guò)其底物P70S6K的磷酸化水平來(lái)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中將足細(xì)胞分化成熟后分為對(duì)照組、co-BSA組、AGE-BSA組,干預(yù)72h后采用Western blot檢測(cè)P70S6K及其磷酸化形式P-P70S6K蛋白水平,比較各組間P-P70S6K蛋白水平。AGE-BSA組較對(duì)照組P-P70S6K蛋白水平明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,co-BSA組與對(duì)照組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(二)雷帕霉素通過(guò)抑制AGE-BSA/mTORC1增強(qiáng)足細(xì)胞自噬活性并保護(hù)足細(xì)胞(1)雷帕霉素通過(guò)抑制AGE-BSA/mTORC1增強(qiáng)足細(xì)胞自噬活性本實(shí)驗(yàn)在AGE-BSA干預(yù)的基礎(chǔ)上再給予雷帕霉素,AGE-BSA+雷帕霉素組較AGE-BSA組mTORC1活性明顯抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)AGE-BSA+雷帕霉素組較AGE-BSA組LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)雷帕霉素通過(guò)抑制AGE-BSA/mTORCl保護(hù)足細(xì)胞檢測(cè)LC3Ⅱ的同時(shí),我們檢測(cè)了足細(xì)胞損傷標(biāo)志物Podocin的變化。AGE-BSA組在給予雷帕霉素處理后較未給予組Podocin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論在AGE-BSA體外介導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型中,mTORC1活化抑制足細(xì)胞自噬體生成從而抑制足細(xì)胞自噬活性可能是一個(gè)引起足細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。這為干預(yù)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：晚期糖基化終產(chǎn)物 足細(xì)胞 自噬 細(xì)胞損傷
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 引言23-28
• 材料與方法28-51
• 結(jié)果51-74
• 討論74-78
• 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-82
• 中英文縮略詞表82-83
• 研究成果83-85
• 致謝85-86

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