本文關(guān)鍵詞：miRNA-92a作用EBAG9基因調(diào)控前列腺癌增殖機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究前列腺癌細(xì)胞中的micro RNA-92a對(duì)EBAG9基因的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。方法:應(yīng)用micro RNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測軟件mi Randa、Target Scan、Pic Tar,預(yù)測mi RNA-92a中的靶基因,再應(yīng)用mi Rwalk取交集基因中210個(gè)基因,從中篩選與腫瘤相關(guān)的10個(gè)靶基因,通過往前列腺癌細(xì)胞系PC3中轉(zhuǎn)染mi RNA-92a的模擬物mimic、抑制物inhibitor和其各自的對(duì)照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,24h后分別提取其RNA,分別利用RT-q PCR方法檢測上述篩選的靶基因的m RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況,并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果篩出靶基因EBAG9,再轉(zhuǎn)染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對(duì)照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,48h后提取總蛋白,利用Western blot檢測EBAG9的蛋白表達(dá)情況。結(jié)合Oncomine數(shù)據(jù)庫,收集天津市泌尿外科研究所40例前列腺癌及正常的前列腺增生組織,提取其RNA并行RT-q PCR,檢測EBAG9基因在腫瘤組織及正常組織的分布。用micro RNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測軟件預(yù)測mi RNA-92a與EBAG9的潛在作用位點(diǎn);設(shè)計(jì)EBAG9引物,利用PCR擴(kuò)增其3’UTR片段,并分別用瓊脂糖凝膠電泳鑒定;目的基因及帶有熒光的質(zhì)粒分別使用限制性內(nèi)切酶酶切,最后將質(zhì)粒與目的基因連接,構(gòu)建含有EBAG9的3’UTR熒光報(bào)告質(zhì)粒;將質(zhì)粒擴(kuò)增進(jìn)而獲取高濃度質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶酶切后行瓊脂糖凝膠電泳后予以驗(yàn)證,使用基因測序進(jìn)而驗(yàn)證其正確性后;分別將含有EBAG9片段的重組質(zhì)粒及mi RNA-192a表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,后用熒光報(bào)告檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性。結(jié)果:1.用數(shù)據(jù)庫預(yù)測軟件mi Randa、Target Scan、Pic Tar、mi Rwalk,成功篩選出與腫瘤相關(guān)的10個(gè)靶基因。2.轉(zhuǎn)染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對(duì)照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 24h后,RT-q PCR驗(yàn)證各個(gè)實(shí)驗(yàn)組EBAG9基因在m RNA水平上變化有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.轉(zhuǎn)染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對(duì)照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 48h后的EBAG9基因表達(dá)蛋白電泳結(jié)果表明,分別抑制和增強(qiáng)PC3細(xì)胞的mi RNA-92a后,EBAG9基因蛋白水平與m RNA水平變化保持一致且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.相對(duì)于正常前列腺增生組織及細(xì)胞,EBAG9基因在前列腺癌細(xì)胞及組織中顯著高表達(dá)。5.成功構(gòu)建EBAG9的野生型3’UTR區(qū)片段,并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其正確性。6.成功構(gòu)建含有野生型的EBAG9的3’UTR區(qū)序列的重組質(zhì)粒,并按正確方向與含有雙熒光素酶報(bào)告基因載體成功鏈接,擴(kuò)增獲得高濃度質(zhì)粒,酶切后的片段用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確。7.使用大腸桿菌擴(kuò)增野生型重組質(zhì)粒得到高濃度質(zhì)粒并經(jīng)測序結(jié)果驗(yàn)證正確。8.使用羅氏成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和mi R-92a表達(dá)質(zhì)粒至293T細(xì)胞后,使用酶標(biāo)儀測雙熒光素酶活性,結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組,mi R-92a可以顯著降低含有EBAG9的3’UTR的重組質(zhì)粒的熒光素酶的活性并具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此實(shí)驗(yàn)顯示EBAG9為mi RNA-92a的靶基因。結(jié)論:1.EBAG9基因在前列腺癌細(xì)胞及組織中顯著高表達(dá),通過臨床病理及資料分析,其與其腫瘤的分級(jí)、分期顯著正相關(guān)。2.mi RNA-92a作用EBAG9的3’UTR進(jìn)而調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖。3.隨著研究的深入,可進(jìn)一步尋找EBAG9基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,進(jìn)而探討其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 增殖 microRNA-92a 靶基因 調(diào)控 轉(zhuǎn)錄
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號(hào)說明11-13
• 前言13-19
• 研究現(xiàn)狀、成果13-18
• 研究目的、方法18-19
• 一、miRNA對(duì)靶基因EBAG9基因的影響19-44
• 1.1 對(duì)象和方法19-33
• 1.1.1 細(xì)胞系及組織標(biāo)本19
• 1.1.2 模擬試劑及引物的合成19-20
• 1.1.3 常用耗材及試劑盒20-21
• 1.1.4 主要的設(shè)備及儀器21-22
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)的試劑配置及過程22-25
• 1.1.6 實(shí)驗(yàn)各種方法25-33
• 1.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果的處理33
• 1.2 結(jié)果33-40
• 1.2.1 miR-92a的靶基因預(yù)測及結(jié)果33-34
• 1.2.2 轉(zhuǎn)染模擬物后靶基因mRNA水平上驗(yàn)證34-37
• 1.2.3 蛋白印記電泳法Western blot檢測前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬物之后的EBAG9基因的表達(dá)37-38
• 1.2.4 EBAG9基因在前列腺癌組織和BPH組織中的表達(dá)情況38-40
• 1.3 討論40-43
• 1.4 小結(jié)43-44
• 二、miRNA-92a對(duì)EBAG9基因調(diào)控機(jī)制的研究44-60
• 2.1 對(duì)象和方法44-53
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料44-47
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟47-53
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法53
• 2.2 miRNA-92a對(duì)EBAG9基因調(diào)控機(jī)制的研究結(jié)果53-57
• 2.2.1 miRNA-92a與靶基因位點(diǎn)結(jié)合示意圖及目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果53-54
• 2.2.2 酶切后的重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖54-55
• 2.2.3 含有EBAG9基因序列的片段及miRNA-92a過表達(dá)質(zhì)粒測序結(jié)果55-56
• 2.2.4 miRNA-92a過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)含有EBAG93’UTR質(zhì)粒雙熒光素酶抑制效果56-57
• 2.3 討論57-59
• 2.4 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明64-66
• 綜述 MicroRNA在前列腺癌研究中的進(jìn)展66-76
• 綜述參考文獻(xiàn)71-76
• 致謝76-77
• 個(gè)人簡歷77

  本文關(guān)鍵詞：miRNA-92a作用EBAG9基因調(diào)控前列腺癌增殖機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：296425