本文選題：星狀病毒　切入點(diǎn)：諾如病毒　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： [研究背景]2008年WHO報(bào)告全球每年因腹瀉死亡的5歲以下兒童達(dá)187萬(wàn),占兒童死亡總數(shù)的19%,且78%分布在非洲和東南亞發(fā)展中國(guó)家。二十世紀(jì)70年代之前,有關(guān)感染性腹瀉的病原學(xué)研究,絕大多數(shù)為細(xì)菌和寄生蟲(chóng)。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,70年代之后,相繼發(fā)現(xiàn)諾如病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腸腺病毒、札如病毒是引起急性水樣瀉的主要病因。上述病毒導(dǎo)致的感染性腹瀉稱(chēng)病毒性腹瀉,在兒童感染性腹瀉中占大多數(shù),目前尚無(wú)有效的藥物治療,接種相關(guān)疫苗可能是控制此類(lèi)疾病的有效的方法。但在制備及使用疫苗過(guò)程中,我們都必須對(duì)致病病毒的流行病學(xué)資料有一個(gè)充分的認(rèn)識(shí)。近幾年國(guó)內(nèi)對(duì)病毒性腹瀉的流行病學(xué)研究已開(kāi)展,但是上海地區(qū)尚未見(jiàn)全面深入的病毒性腹瀉分子流行病學(xué)研究報(bào)告。因此我們前瞻性地收集2008年8月至2009年7月的腹瀉患兒標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)病毒的分子流行病學(xué)研究。 本研究共分為三部分：(一)部分腹瀉病毒基因診斷方法的建立與優(yōu)化；(二)上海地區(qū)兒童病毒性腹瀉病原學(xué)調(diào)查；(三)上海地區(qū)腹瀉病毒的基因型分布及核酸序列分析。 第一部分部分腹瀉病毒基因診斷方法的建立與優(yōu)化 目的①建立快速靈敏的人星狀病毒基因檢測(cè)方法,為人星狀病毒的檢測(cè)提供技術(shù)支持。②改良諾如病毒普通RT-PCR方法以便利于擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序。材料與方法①下載Genbank中所有人星狀病毒全基因序列以及衣殼區(qū)序列,進(jìn)行多重比對(duì),尋找保守區(qū),使用引物探針設(shè)計(jì)軟件結(jié)合實(shí)際檢測(cè)情況對(duì)所選引物和探針進(jìn)行評(píng)價(jià)。將建立的一步法Taqman探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與普通RT-PCR進(jìn)行比較。②在擴(kuò)增諾如病毒的原始文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對(duì)其兼并引物進(jìn)行改進(jìn),使用諾如病毒陽(yáng)性標(biāo)本的倍比稀釋液進(jìn)行改進(jìn)后的檢測(cè)評(píng)價(jià)結(jié)果①所建立的星狀病毒一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR比常規(guī)RT-PCR敏感1000倍,特異性良好。②改良后的引物擴(kuò)增靈敏度和原引物無(wú)差別,但改良后引物擴(kuò)增后產(chǎn)物可直接進(jìn)行測(cè)序,而原引物擴(kuò)增產(chǎn)物需克隆測(cè)序。結(jié)論①建立了一種一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法可應(yīng)用于星狀病毒的基因檢測(cè)。②改良了諾如病毒普通RT-PCR引物使得其擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用于測(cè)序。 第二部分上海地區(qū)兒童病毒性腹瀉病原學(xué)調(diào)查 目的了解上海地區(qū)兒童各種病毒性腹瀉流行病學(xué)情況,為病毒性腹瀉防治提供背景資料。材料與方法隨機(jī)抽樣采集上海兒科醫(yī)院2008年8月至2009年7月患有急性腹瀉病兒童的糞便標(biāo)本共910份,膠體金法檢測(cè)輪狀病毒,病毒DNA/RNA共抽提試劑盒抽提核酸,使用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)諾如病毒基因型GⅠ和GⅡ,札如病毒,人星狀病毒,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR初步檢測(cè)腺病毒,并用普通PCR再次對(duì)腺病毒陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒和腺病毒全年檢出率分別為29.5%,18.1%,6.5%,3.3%和6.5%。輪狀病毒以10,11,12,1月份檢出率較高,在38.0%-70.5%之間,在春夏季節(jié)亦有檢出,檢出率在10.5%-29.5%之間。諾如病毒全年可見(jiàn)散發(fā),但在2008年8月、9月和2009年7月有明顯的流行高峰。札如病毒、星狀病毒和腺病毒感染未發(fā)現(xiàn)有明顯季節(jié)分布特點(diǎn)。輪狀病毒腹瀉患兒主要集中在3歲以下嬰幼兒,占全部此類(lèi)患兒的91.0%。絕大部分諾如病毒感染的兒童(94.0%)小于3歲。大部分札如病毒(88.1%)、星狀病毒(85.5%)和腺病毒感染的兒童(98.3%)小于5歲。結(jié)論輪狀病毒和諾如病毒是上海地區(qū)兒童病毒性腹瀉的最主要病原體,札如病毒、星狀病毒和腺病毒為常見(jiàn)病原體。輪狀病毒流行高峰為秋冬季,諾如病毒流行高峰為夏秋季,札如病毒、星狀病毒和腺病毒感染沒(méi)有明顯的季節(jié)分布特點(diǎn)。5歲以下兒童為病毒性腹瀉的易感人群。 第三部分上海地區(qū)腹瀉病毒的基因型分布及核酸序列分析 目的了解各種病毒性腹瀉的分子流行病學(xué)特點(diǎn),明確各種病毒分子特征及基因型流行分布情況,為疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。材料與方法分別對(duì)第二部分各種病毒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒基因分型,其中輪狀病毒采用多重巢式RT-PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行G分型和P分型,而諾如病毒、札如病毒、星狀病毒和腺病毒使用直接測(cè)序,構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)的方法進(jìn)行基因分型。此外,諾如病毒和札如病毒進(jìn)行兩個(gè)不同區(qū)域的測(cè)序并進(jìn)行重組分析。結(jié)果①輪狀病毒G分型以G1最多,占33.7%,以下依次為G3(20.8%),混合型(20.2%),G2(14.6%),G9(6.7%),G4(2.2%)。P分型以P[8]為主,占77.8%,而P[4]占17.0%,其它少見(jiàn)分型占1.7%。②165份諾如病毒陽(yáng)性衣殼區(qū)測(cè)序成功113份,65份(57.5%)為GⅡ.42006b變異株,35份(31.0%)GⅡ.3亞型,7份(6.2%)GⅡ.6,4份(3.5%)GⅡ.12,1份(0.9%)GⅡ.14,1份(0.9%)GⅡ.2,1份(0.9%)G 1.4,1份(0.9%)G 1.5。多聚酶區(qū)測(cè)序成功102份,96份為GⅡ.4(64份GⅡ.42006b株,33份其他GⅡ.4型),2份GⅡ.2,2份GⅡ.3,2份GⅡ.9。91份諾如病毒GⅡ株衣殼區(qū)和多聚酶分型都成功,58份(63.7%)為GⅡ.4/GⅡ.4,25份(27.5%)GⅡ.4/GⅡ3,2份(2.2%)GⅡ.6/GⅡ.9,2份(2.2%)GⅡ.6/GⅡ.4,2份(2.2%)GⅡ.12/GⅡ.3,1份(1.1%)GⅡ.12/GⅡ.4,1份(1.1%)GⅡ.2/GⅡ.2。1份(1.1%)GⅠ.4。③59例札如病毒陽(yáng)性標(biāo)本使用SR80/JV33測(cè)序成功13份,SLV5317/SLV5749測(cè)序成功14份,其中有8份兩者均成功。綜合基于兩區(qū)的分型方法,共發(fā)現(xiàn)8份GⅠ.1,4份GⅡ.1,3份GIV,1份G I.2,1份G I.3,1份G I.3和1份GⅠ.8。其中同時(shí)擴(kuò)增成功的8份標(biāo)本使用兩種分型方式結(jié)果一致。④30份星狀病毒陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)序成功20份,1型(12/20,60%),4型(8/20,40%),1型又可分為3個(gè)系譜lb,1d和1a,以系譜1b為主,4型都?xì)w屬于一個(gè)系譜4a。⑤59份腺病毒陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)序成功58份,分子進(jìn)化樹(shù)顯示32份(55.2%)為血清41型,2份(3.4%)為血清40型,9份(15.5%)為血清2型,5份(8.6%)為血清3型,4份(6.9%)為血清1型,3份(5.2%)為血清31型,1份(1.7%)為血清15型,2份(3.4%)未能分型。結(jié)論①上海輪狀病毒流行株與其他國(guó)家大致相同,目前上市的疫苗毒株血清型基本包含上海流行株。目前G1P[8]為上海主要流行株。②GⅡ.42006b變異株為目前優(yōu)勢(shì)株,但重組株GⅡ.4/GⅡ.3可能已經(jīng)在上海乃至全國(guó)廣泛傳播。③上海地區(qū)存在多種型別的札如病毒,但目前尚未發(fā)現(xiàn)存在重組札如病毒株。④星狀病毒在上海地區(qū)除了常見(jiàn)的血清1型外,血清4型亦比較多見(jiàn)。⑤腺病毒中血清41型為最主要流行型別,血清31型可能也是病毒性腹瀉的病原體之一。
[Abstract]:The World Health Organization ( WHO ) reported that the World Health Organization ( WHO ) reported that children under 5 years of age who died annually from diarrhoea reached 187.2 million , accounting for 19 % of the total number of deaths and 78 % of them distributed in the developing countries of Africa and Southeast Asia .



This study is divided into three parts : ( 1 ) establishment and optimization of partial diarrhea virus gene diagnosis method ;
( 2 ) The etiological investigation of children ' s viral diarrhea in Shanghai ;
( 3 ) The genotype distribution and nucleic acid sequence analysis of diarrhea virus in Shanghai area .



Establishment and optimization of diagnostic methods for the first part of diarrhea virus gene



Objective 鈶，

本文編號(hào)：1687360