本文關鍵詞：Smad3與C-jun調(diào)控成釉細胞Mmp20基因轉錄活性的研究

  更多相關文章： C-jun 基質(zhì)金屬蛋白酶-20 Mmp20 Smad3 成釉細胞

【摘要】：目的通過分析Mmp20基因下游啟動子上的AP-1位點和Smad位點,探討C-jun和Smad3在Mmp20基因表達中的作用。方法1、對p-Mmp20的分析：首先構建包含不同長度p-Mmp20片段的熒光素酶報告基因載體；然后通過雙熒光素酶檢測Smad3對其轉錄活性的影響；并將小鼠有功能的Mmp20啟動子基因序列與人的相應序列進行BLASTN分析及TFSEARCH、TESS分析。2、Smad3促進p-Mmp20轉錄活性的研究：首先雙熒光素酶分析不同劑量Smad3對p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的影響；其次凝膠遷移實驗觀察Smad3核蛋白與標記探針的相互作用；利用基因定點突變技術使Mmp20啟動子序列(-157bp～+23bp)內(nèi)Smad及AP-1位點突變,然后雙熒光素酶觀察Smad3對野生型及突變型啟動子活性的影響。3、C-jun影響Mmp20基因表達的研究：首先雙熒光素酶分析不同劑量C-jun對p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的影響及C-jun對p-Mmp20 (M3-MT-SBS, M3-MT-ABS, M3-MT-DS)活性的影響；其次通過凝膠遷移實驗觀察C-jun核蛋白與標記探針之間的結合；然后雙熒光素酶觀察C-jun與Smad3對p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的調(diào)節(jié)。4、磷酸化C-jun與磷酸化Smad3在ALC中表達的研究：利用RT-PCR技術檢測在Smad3存在情況下,C-jun對Mmp20基因表達的影響；利用免疫組化技術研究磷酸化C-jun與磷酸化Smad3在ALCs內(nèi)的表達。5、分析Smad3通路與JNK通路在Smad3、C-jun調(diào)控Mmp20基因表達中的作用：利用RT-PCR分析在Smad3 inhibitor存在情況下,C-jun對Mmp20基因表達的影響；利用RT-PCR分析在JNK inhibitor存在情況下,Smad3對Mmp20基因表達的影響。 結果1、雙熒光素酶檢測不同長度Mmp20啟動子的熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)：從-157bp～-73bp之間存在順式作用元素。BLASTN分析發(fā)現(xiàn)人鼠該序列具有同源性。TFSEARCH、TESS分析該功能性序列得到Smad及AP-1結合位點。2、雙熒光素酶分析發(fā)現(xiàn)Smad3促進p-Mmp20 (M3)的熒光素酶活性并具有劑量依賴性；電泳遷移率實驗可以觀察到含Smad結合位點的探針與Smad3核蛋白具有相互作用；雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),Smad3過表達可上調(diào)M3的轉錄活性；與M3-WT相比,Smad3位點的突變可明顯抑制M3的活性(P0.05)。3、雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)：低劑量的C-jun促進M3啟動子活性,高劑量的C-jun抑制M3啟動子活性；AP-1位點突變后,只是輕微改變C-jun對M3啟動子活性的抑制效應,Smad位點突變后,C-jun明顯增強M3啟動子活性,AP-1及Smad位點均突變后完全消除C-jun對M3活性的影響。凝膠遷移實驗得出C-jun核蛋白可以與標記探針上的AP-1位點結合,C-jun與Smad3的復合物可以與標記探針上的Smad位點結合。雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)在C-jun存在的情況下,Smad3抑制M3的活性。4、RT-PCR分析：低劑量C-jun促進Mmp20 mRNA的表達與Smad3沒有明顯聯(lián)系；與對照組相比,在Smad3存在的情況下,高劑量C-jun明顯抑制Mmp20的表達。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)p-Smad3在出生后3d、5d、7d小鼠下頜第一磨牙成釉細胞核內(nèi)的分布含量沒有明顯改變；而p-C-jun的含量逐漸增加。5、RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在Smad3 inhibitor存在的情況下,C-jun促進Mmp20表達；在JNK inhibitor作用下,Smad3增強Mmp20表達。 結論證實Smad3通過作用于p-Mmp20上的Smad位點促進Mmp20表達；低劑量C-jun通過p-Mmp20上的AP-1位點促進Mmp20的表達,高劑量C-jun與Smad3形成復合物通過Smad位點抑制Mmp20的表達；JNK通路參與了Smad3對Mmp20表達的調(diào)節(jié),Smad3通路參與了C-jun對Mmp20表達的調(diào)節(jié)。
【關鍵詞】：C-jun 基質(zhì)金屬蛋白酶-20 Mmp20 Smad3 成釉細胞
【學位授予單位】：濱州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 縮略詞表9-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-34
• 結果34-44
• 討論44-47
• 結論47-48
• 參考文獻48-51
• 文獻綜述51-57
• 參考文獻55-57
• 致謝57-58
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文58

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本文編號：843736