口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤。盡管傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療及其綜合治療對早期OSCC可獲得較好的治療效果,但對于晚期或復(fù)發(fā)的病人難以達(dá)到滿意的療效。因此,研究OSCC發(fā)病的分子機(jī)制,尋找其早期診斷和治療的分子標(biāo)志物,將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方法和提高口腔腫瘤病人的生存率和生存質(zhì)量。越來越多的研究提示,惡性腫瘤實(shí)質(zhì)上是一種基因疾病,其發(fā)生、發(fā)展涉及到多種基因的改變。抑瘤基因（tumor suppressor gene, TSG）在人體內(nèi)往往發(fā)揮非常重要的生理功能,其失活、缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多抑瘤基因的發(fā)現(xiàn)都是通過研究等位基因雜合性丟失或純合性丟失（loss of heterozygosity/homozygosity, LOH）而實(shí)現(xiàn)的。研究表明,染色體3p21.3區(qū)域在肺癌、鼻咽癌等多種腫瘤組織中表現(xiàn)為高頻缺失,并存在多個與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的候選抑瘤基因。多個研究小組發(fā)現(xiàn),該區(qū)域在OSCC中同樣存在不同程度高頻缺失（23%-50%）。目前,該區(qū)域內(nèi)候選抑瘤基因在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用還鮮少有人研... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
技術(shù)路線圖
第一章 3p21.3區(qū)候選抑瘤基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的篩選及其甲基化在基因表達(dá)中的作用
    第一節(jié) 材料和方法
        1 材料
            1.1 細(xì)胞和細(xì)胞系
            1.2 標(biāo)本
            1.3 引物
                1.3.1 RT-PCR引物
                1.3.2 MSP引物
            1.4 菌株和載體
                1.4.1 菌株
                1.4.2 載體
            1.5 主要試劑/試劑盒
            1.6 主要儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 組織和細(xì)胞總RNA的提取
                2.1.1 RNA的制備
                2.1.2 RNA中痕量DNA的去除
                2.1.3 總RNA的鑒定
            2.2 兩步法差異RT-PCR
                2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
                2.2.2 PCR反應(yīng)
                2.2.3 平臺期循環(huán)數(shù)的確定
                2.2.4 灰度掃描與分析
            2.3 組織和細(xì)胞基因組DNA的提取
            2.4 MSPCR
                2.4.1 亞硫酸鹽處理DNA
                2.4.2 MSP
                2.4.3 結(jié)果判定及分析
            2.5 PCR產(chǎn)物純化測序
            2.6 甲基化產(chǎn)物測序
                2.6.1 制備感受態(tài)
                2.6.2 連接T載體
                2.6.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
                2.6.4 測序
            2.7 5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-CdR)處理舌癌細(xì)胞系
            2.8 統(tǒng)計學(xué)方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1 生物信息學(xué)分析確定待分析基因
        2 RNA質(zhì)量檢測
        3 基因擴(kuò)增平臺期的測定
        4 半定量RT-PCR檢測候選基因的表達(dá)情況
        5 四個下調(diào)基因在TCA8113細(xì)胞和36對OSCC組織中的表達(dá)
        6 MSP分析基因在OSCC及其癌旁對照組織中甲基化情況
    第三節(jié) 分析與討論
        1 染色體3p21.3區(qū)候選抑瘤基因在OSCC中的表達(dá)
        2 啟動子區(qū)異常甲基化對基因表達(dá)的影響
第二章 LTF基因在舌癌中的生物學(xué)功能研究
    第一節(jié) 材料與方法
        1 材料
            1.1 細(xì)胞系
            1.2 標(biāo)本
            1.3 菌株和載體
            1.4 引物
            1.5 主要試劑
            1.6 主要儀器
        2 方法
            2.1 組織和細(xì)胞總RNA的提取
            2.2 Real-time quantitative PCR(實(shí)時熒光定量PCR)
            2.3 免疫組化
            2.4 LTF/pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.4.1 質(zhì)粒酶切、純化和重組
                2.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
                2.4.3 LTF/pcDNA3.1真核表達(dá)載體的鑒定
            2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.6 建立穩(wěn)定表達(dá)LTF基因的TCA8113舌癌細(xì)胞系
            2.7 培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)制備
            2.8 BCA法蛋白定量
            2.9 Western Blotting分析
            2.10 免疫細(xì)胞化學(xué)
            2.11 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
            2.12 噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力
            2.13 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
            2.14 統(tǒng)計學(xué)方法
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1 Real-time RT-PCR分析LTF的表達(dá)
        2 LTF蛋白在口腔鱗癌組織中的定位表達(dá)
        3 LTF基因mRNA水平以及蛋白水平表達(dá)分析的小結(jié)
        4 真核表達(dá)載體LTF/pcDNA3.1(-)的構(gòu)建
            4.1 載體構(gòu)建策略及流程
            4.2 pCMV6-XL5-LTF載體的鑒定
            4.3 真核表達(dá)載體LTF/pcDNA3.1(-)的構(gòu)建
        5 建立穩(wěn)定表達(dá)LTF基因的TCA8113細(xì)胞系
            5.1 細(xì)胞克隆的篩選
            5.2 RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆中LTF基因mRNA水平的表達(dá)
            5.3 PCR鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中pcDNA3.1(-)載體的整合
            5.4 Western Blotting檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后TCA8113細(xì)胞中LTF蛋白的表達(dá)
            5.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測LTF蛋白的表達(dá)及定位
        6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LTF基因?qū)ι喟┘?xì)胞TCA8113細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
            6.1 LTF基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響
            6.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
            6.3 LTF基因?qū)?xì)胞周期的影響
    第三節(jié) 分析與討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
攻讀學(xué)位期間主要研究成果(第一作者)
在讀期間承擔(dān)課題(第三責(zé)任人)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA甲基化與膀胱癌研究進(jìn)展[J]. 郭萬松,楊波,叢憲玲,孔祥波.  中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2009(08)
[2]口腔鱗狀細(xì)胞癌中凋亡蛋白酶活化因子甲基化的研究[J]. 李春艷,高文信,周延民,張茹慧,趙靜輝,李秋實(shí),李艷秋.  口腔醫(yī)學(xué)研究. 2009(03)
[3]DNA甲基化與結(jié)腸癌[J]. 李新,羅鵬,劉莉.  國際消化病雜志. 2009(01)
[4]DNA甲基化與宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 陳勇,陳雙鄖,馮景.  鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2009(01)
[5]口腔癌的臨床病理特征與預(yù)后[J]. 李江.  中國口腔頜面外科雜志. 2008(01)
[6]口腔粘膜癌前病變及鱗癌中RASSF1A基因甲基化與表達(dá)的研究[J]. 萬揚(yáng),高文信,陳英新,崔玉波,劉永茂.  現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2007(01)
[7]鼻咽癌組織中GNAT1基因的表達(dá)、雜合性丟失及甲基化分析[J]. 易紅梅,任彩萍,彭丹,周亮,李輝,姚開泰.  癌癥. 2007(01)
[8]SEMA3B基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)、雜合性丟失和甲基化分析[J]. 易紅梅,任彩萍,彭丹,楊旭宇,趙明,姚開泰.  生命科學(xué)研究. 2006(02)
[9]DNA甲基化及其在腫瘤分子診斷中的前景[J]. 朱景德.  中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2005(07)
[10]CDKN2A研究進(jìn)展[J]. 闞衛(wèi)兵,方肇勤,耿琳.  國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊). 2004(07)



本文編號：3466510