背景和目的 正畸牙移動(dòng)是通過在機(jī)械力作用下牙周組織發(fā)生改建來完成的。其中尤以牙槽骨的改建最為重要,它是骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡過程。目前研究證實(shí)在牙槽骨改建的過程中,牙周膜的生物力學(xué)反應(yīng)起著至關(guān)重要的介導(dǎo)和調(diào)控作用。牙周膜是具有成骨能力的骨/牙界面,是一種變異的骨膜,具有明顯的骨吸收和骨形成能力。已有研究證實(shí)牙周膜細(xì)胞中包含具有分化潛能的成纖維細(xì)胞群體,正畸機(jī)械力能誘導(dǎo)其表達(dá)一些成骨細(xì)胞的表型和功能蛋白,向成骨樣細(xì)胞分化。牙周膜細(xì)胞分化為成骨樣細(xì)胞,參與骨吸收和骨形成,是正畸骨改建的關(guān)鍵。 牙周膜細(xì)胞通過特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)機(jī)械力做出反應(yīng),引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。這是一個(gè)復(fù)雜的過程,在牙周膜細(xì)胞內(nèi)及周圍發(fā)生許多層網(wǎng)狀反應(yīng),而將應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿邮录?信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)),引起牙周組織改建。此過程涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,比如:骨形成蛋白2(BMP-2)、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、P物質(zhì)、血管活性肽、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素Ⅰ2(PGⅠ2)、動(dòng)力敏感鈣離子通道和白介素系列等。近年少量研究發(fā)現(xiàn),一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(c-Fos、c-Jun、核心結(jié)合因子α1和轉(zhuǎn)錄激活因子4等)也參與了牙周膜細(xì)胞內(nèi)調(diào)控途徑,將細(xì)胞外物理或機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細(xì)胞反應(yīng)。 Osterix(Osx)是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。人類Osx同源物又稱為Sp7(specific protein7),屬于Sp/XKLF家族,是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。Osx調(diào)控許多重要的成骨基因的表達(dá),如骨鈣素(osteocalcin,OC)、骨粘素、骨橋素(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和a1(Ⅰ)型膠原蛋白(collagenⅠ,ColⅠ)。Osx單獨(dú)作用就可有效誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系。在Osx基因剔除小鼠胚胎中,成骨細(xì)胞的分化受到阻礙,各種成骨分化標(biāo)志的表達(dá)水平也嚴(yán)重降低或缺如。其中OC作為一種高度特異性的晚期成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)缺失,說明成骨細(xì)胞的分化、成熟被完全阻斷。研究發(fā)現(xiàn),15.5d的Osx(-/-)小鼠胚胎中無礦化反應(yīng),完全喪失骨形成能力;新生的Osx(-/-)小鼠因礦化缺失,呼吸困難,出生后15min內(nèi)即死去。這些研究說明Osx是成骨細(xì)胞分化和骨發(fā)育不可缺少的調(diào)節(jié)因子。2002年,Nakashima等研究發(fā)現(xiàn)Osx在牙胚的間葉細(xì)胞中有陽性信號(hào)顯示;2006年Kumamoto H等研究也發(fā)現(xiàn)Osx mRNA在牙胚、造釉細(xì)胞瘤牙源性組織中均有陽性表達(dá)。這些表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發(fā)育中具有重要的作用。Osx作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,與骨發(fā)育和牙齒發(fā)育關(guān)系的研究正在不斷開展。但Osx在正畸牙齒移動(dòng)牙周組織的表達(dá)和分布,機(jī)械力作用下在體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)變化情況,以及在人牙周膜細(xì)胞受力后向成骨樣細(xì)胞分化的過程中所起的作用,國內(nèi)外尚未有報(bào)道。 本研究通過建立大鼠正畸牙齒移動(dòng)的動(dòng)物模型和體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,結(jié)合體內(nèi)外加力實(shí)驗(yàn)技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)技術(shù),擬從組織、細(xì)胞水平以及分子生物學(xué)角度探討Osx在正畸牙齒移動(dòng)過程中對(duì)牙周組織改建的影響及作用機(jī)制,以期為進(jìn)一步系統(tǒng)性研究正畸力作用下牙周組織骨改建的分子生物學(xué)機(jī)制開辟一條新途徑。 方法 1.觀察大鼠正畸牙周組織改建過程中Osx的表達(dá)變化 以大鼠上頜右側(cè)第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙,采用拉簧加力法建立正畸牙齒移動(dòng)的動(dòng)物模型。在加力0h、1h、2h、4h、8h、12h、1d、3d、5d、7d和14d后,處死大鼠,固定,脫鈣,制作大鼠第一磨牙牙周組織石蠟切片,采用HE染色觀察牙周組織形態(tài)學(xué)變化,并采用免疫組化方法半定量分析Osx在牙周組織的表達(dá)變化。 2.觀察機(jī)械力加載下人牙周膜細(xì)胞Osx mRNA和蛋白的表達(dá)變化 采用組織塊法培養(yǎng)原代人牙周膜細(xì)胞,并做波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體染色鑒定。取生長狀態(tài)良好的第2-3代人牙周膜細(xì)胞,按2.5×10~5個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%,換用含2%FBS的條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。后將六孔板置于37℃離心機(jī)加力支架中,實(shí)驗(yàn)組以離心機(jī)加力(631rpm,約80g相對(duì)離心力),加力時(shí)間分別為1h、2h、4h、6h、8h和12h。加力結(jié)束后,采用Real-time RT-PCR和Western blot方法分別觀察Osx mRNA和蛋白表達(dá)情況;同時(shí),采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測Osx蛋白綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位,并統(tǒng)計(jì)分析Osx蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量及其核內(nèi)陽性表達(dá)的細(xì)胞比例。 3.觀察Osx過表達(dá)對(duì)人牙周膜細(xì)胞骨向分化的影響 取生長狀態(tài)良好的第2-3代人牙周膜細(xì)胞,按2.5×10~5個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%,按陽離子脂質(zhì)體Lipofeetamine ~(TM)2000說明操作,用獲贈(zèng)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1 flag轉(zhuǎn)染人牙周膜細(xì)胞。采用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(pcDNA3.1 flag)、轉(zhuǎn)染目的基因(pcDNA3.1 flag-Osx)三組細(xì)胞Osx mRNA和蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用試劑盒檢測三組細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性變化;并采用RT-PCR技術(shù)觀察Cbfal及相關(guān)成骨標(biāo)志基因(ALP、OPN、OC、BSP和ColⅠ)的mRNA表達(dá)情況。三組細(xì)胞均加載6h離心力(631rpm)后,再次觀察三組細(xì)胞的上述檢測指標(biāo)變化。 4.觀察人重組骨形成蛋白2(rhBMP-2)作用下人牙周膜細(xì)胞Osx的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞,以1×10~5個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。孵育24小時(shí)后,加入含rhBMP-2的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組1)按照不同的濃度分組:實(shí)驗(yàn)組用含10%FBS和濃度分別為50、100、150、200、250、300、400、600ng/ml rhBMP-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),誘導(dǎo)7d。每種濃度加6孔。2)按培養(yǎng)時(shí)間分組:實(shí)驗(yàn)組用含10%FBS和濃度為200ng/ml的rhBMP-2的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)2d、3d、5d、7d、10d、14d和21d。每組加6孔。兩對(duì)照組細(xì)胞均用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,采用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測各組細(xì)胞Osx mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 1.大鼠正畸牙周組織改建過程中Osx的表達(dá)變化 在正常對(duì)照組,Osx在牙周膜呈弱陽性表達(dá),分布較均勻,在靠近牙骨質(zhì)側(cè)牙周膜部分著色相對(duì)較重。正畸加力后大鼠牙周組織中Osx表達(dá)增強(qiáng),表達(dá)貫穿正畸牙周組織改建的全過程。加力1d時(shí),在壓力區(qū)和張力區(qū)牙周膜Osx陽性著色均已顯著增強(qiáng),著色分布較均勻,且兩側(cè)著色強(qiáng)度無明顯差異。隨著加力時(shí)間的延長,Osx著色分布發(fā)生一定的改變。在張力區(qū),靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜區(qū)域強(qiáng)陽性表達(dá);在壓力區(qū),靠近牙骨質(zhì)表面的牙周膜強(qiáng)陽性表達(dá),而在發(fā)生明顯骨吸收的牙槽骨側(cè)無明顯著色,而且張力區(qū)整體上比壓力區(qū)陽性染色深,新骨形成區(qū)域陽性染色較強(qiáng)。 2.機(jī)械力作用下人牙周膜細(xì)胞Osx mRNA和蛋白的表達(dá)變化 Osx mRNA在正常人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)極其微弱。在機(jī)械力加載下,OsxmRNA的表達(dá)發(fā)生了一系列變化:細(xì)胞加力1h、2h時(shí),Osx mRNA的表達(dá)略升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;加力4h時(shí),表達(dá)開始明顯增強(qiáng)(P＜0.01);隨后快速增加至8h,表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);后表達(dá)緩慢增加,持續(xù)到12h加力結(jié)束。 Osx蛋白在正常人牙周膜細(xì)胞中未見表達(dá)。細(xì)胞加載80g離心力1h、2h時(shí),仍未檢測到Osx蛋白表達(dá)(P＞0.05);加力4h時(shí),呈現(xiàn)弱表達(dá)(P＜0.05);6h、8h時(shí),表達(dá)逐漸增加(P＜0.01);12h時(shí),表達(dá)顯著增強(qiáng),達(dá)到最高水平。變化具有時(shí)間依從性。 免疫熒光檢測結(jié)果顯示:正常的人牙周膜細(xì)胞內(nèi)無綠色熒光顯現(xiàn);加力1h、2h的細(xì)胞內(nèi)仍未檢測到Osx陽性表達(dá)產(chǎn)物;加力4h后,少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始呈現(xiàn)微弱的綠色熒光(P＜0.01);加力8h時(shí),約40%-50%的細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光,細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有陽性表達(dá)產(chǎn)物;加力12h時(shí),大部分細(xì)胞(約87%)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá),且主要集中在細(xì)胞核內(nèi)。 3.Osx過表達(dá)對(duì)人牙周膜細(xì)胞骨向分化的影響 轉(zhuǎn)染24h后,轉(zhuǎn)染目的基因pcDNA3.1 flag-Osx組Osx mRNA表達(dá)水平相對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞升高28.1倍,同時(shí)Osx蛋白亦呈現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈的表達(dá)(P＜0.01)。相反,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(pcDNA3.1 flag)組的Osx mRNA和蛋白水平相對(duì)未轉(zhuǎn)染組無明顯變化(P＞0.05)。加力6h后,未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染Osx組三組細(xì)胞Osx表達(dá)水平均明顯升高,但轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達(dá)增加量約為其他兩組的2倍。 正常人牙周膜細(xì)胞表達(dá)ALP,轉(zhuǎn)染目的基因Osx后,ALP表達(dá)活性明顯升高(P＜0.05),約為正常細(xì)胞的2.5倍,但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組ALP表達(dá)未發(fā)生明顯變化。三組細(xì)胞受到80g離心力,ALP表達(dá)均升高,但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,受力后ALP表達(dá)無明顯差異(P＞0.05),而轉(zhuǎn)染Osx質(zhì)粒組受力后ALP表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.01),增長量約為未轉(zhuǎn)染組的2.3倍。 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組間,Cbfal及五個(gè)成骨標(biāo)志基因(ALP、OPN、OC、BSP和ColⅠ)的mRNA表達(dá)變化無明顯差異(P＞0.05)。與未轉(zhuǎn)染組相比,細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的基因Osx后,Cbfal mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05),但五個(gè)成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)均明顯升高(~*P＜0.05,~(**)P＜0.01)。加力6h后,三組細(xì)胞的Cbfal mRNA表達(dá)無明顯變化,而ALP、OPN、OC、BSP和Col I的mRNA表達(dá)水平均升高。但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比,受力后五個(gè)成骨標(biāo)志基因變化無明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染Osx細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,受力后五個(gè)成骨標(biāo)志基因mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(~*P＜0.05,~(**)P＜0.01)。 4.rhBMP-2作用下人牙周膜細(xì)胞Osx的表達(dá) 人牙周膜細(xì)胞在不同濃度rhBMP-2誘導(dǎo)7d后,相對(duì)對(duì)照組,Osx mRNA和蛋白均有明顯的表達(dá),但其表達(dá)強(qiáng)度不同,當(dāng)濃度小于200ng/ml時(shí),隨著rhBMP-2濃度的增加,Osx mRNA和蛋白的表達(dá)均逐漸顯著增強(qiáng),當(dāng)大于200ng/ml時(shí),隨著rhBMP-2濃度的增加,Osx mRNA和蛋白的表達(dá)略增加,基本趨于平緩。 在200ng/ml rhBMP-2不同時(shí)間誘導(dǎo)下,Osx mRNA表達(dá)變化具有時(shí)效性,具體如下:2d時(shí),Osx mRNA表達(dá)略增強(qiáng),但仍較弱(P＞0.05);培養(yǎng)3d時(shí),Osx mRNA表達(dá)開始上調(diào)(P＜0.05);后迅速增強(qiáng);10d時(shí)達(dá)到最高峰(P＜0.01);后逐漸減弱,但仍顯著高于正常人牙周膜細(xì)胞中的水平。200ng/ml rhBMP-2誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞2d時(shí),未檢測到Osx蛋白的表達(dá);培養(yǎng)3d、5d時(shí),Osx蛋白開始略有表達(dá)(P＜0.05);后表達(dá)逐漸增強(qiáng),持續(xù)至21d(P＜0.01),表達(dá)趨于平穩(wěn)。 結(jié)論 1.大鼠正畸牙齒移動(dòng)過程中,牙周組織Osx表達(dá)增強(qiáng)貫穿牙周組織骨改建的全過程,且變化具有一定時(shí)空規(guī)律性。從而確定Osx參與了大鼠體內(nèi)牙齒移動(dòng)過程中的牙周組織骨改建。 2.應(yīng)力刺激誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞骨向分化過程中,Osx基因表達(dá)增強(qiáng)、蛋白合成活化,從而發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。從體外細(xì)胞水平證實(shí)Osx參與了正畸力誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞骨向分化和牙周組織骨改建過程。 3.Osx通過上調(diào)成骨表型蛋白和功能蛋白的表達(dá),促進(jìn)加載下的人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。 4.Osx是機(jī)械刺激和人牙周膜細(xì)胞骨向分化間的一個(gè)重要分子環(huán)節(jié),在機(jī)械力誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞成骨分化過程中,發(fā)揮著信號(hào)級(jí)聯(lián)放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控作用。 5.BMP-2信號(hào)通路可能是介導(dǎo)機(jī)械信號(hào)誘導(dǎo)Osx表達(dá)的一條重要途徑。 6.本研究為進(jìn)一步系統(tǒng)性探討機(jī)械力作用下牙周組織骨改建的分子生物學(xué)機(jī)制開辟了一條新途徑,有助于更好的理解正畸牙齒移動(dòng)的機(jī)理,從而為加快牙齒移動(dòng)的正畸臨床研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R783.5
【部分圖文】：

山東大學(xué)博士學(xué)位論文圖1一2正常大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜IIE染色 (x100)(A):遠(yuǎn)中側(cè);(B):近中側(cè)圖1一加力1天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜RE染色(x100)A:遠(yuǎn)中張力區(qū);B:近中壓力區(qū)圖1一加力7天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜BE染色(x100)(A):遠(yuǎn)中張力區(qū);(B):近中壓力區(qū)

山東大學(xué)博士學(xué)位論文圖1一2正常大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜IIE染色 (x100)(A):遠(yuǎn)中側(cè);(B):近中側(cè)圖1一加力1天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜RE染色(x100)A:遠(yuǎn)中張力區(qū);B:近中壓力區(qū)圖1一加力7天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜BE染色(x100)(A):遠(yuǎn)中張力區(qū);(B):近中壓力區(qū)

圖1一2正常大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜IIE染色 (x100)(A):遠(yuǎn)中側(cè);(B):近中側(cè)圖1一加力1天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜RE染色(x100)A:遠(yuǎn)中張力區(qū);B:近中壓力區(qū)圖1一加力7天大鼠近遠(yuǎn)中牙周膜BE染色(x100)(A):遠(yuǎn)中張力區(qū);(B):近中壓力區(qū)
【引證文獻(xiàn)】

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1 孫靜;牙周膜相關(guān)蛋白-1（PLAP-1）對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響[D];山東大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2870480