目的分離培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,探討其基本的增殖、分化等生物學(xué)特性,通過(guò)利用電容耦合電刺激牙髓細(xì)胞,研究其對(duì)體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞增殖的影響,以探索利用微電流環(huán)境在牙組織工程中應(yīng)用的前景。 方法從正畸減數(shù)拔除的年輕恒前磨牙中分離、培養(yǎng)牙髓細(xì)胞,傳代三代至八代的細(xì)胞用于生物學(xué)特性試驗(yàn)研究:1、利用相差顯微鏡觀(guān)察系細(xì)胞的一般形態(tài). 2、記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn). 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面分子的表達(dá). 4、誘導(dǎo)礦化,通過(guò)免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)等鑒定其誘導(dǎo)分化的結(jié)果。在生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上,對(duì)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞施加場(chǎng)強(qiáng)30V/cm ,頻率分別為5、25、50、75、100KHz的電容耦合電刺激,30min/d,連續(xù)作用4d,觀(guān)察不同頻率電容耦合電刺激對(duì)人牙髓細(xì)胞體外增殖作用的影響,對(duì)照組正常狀態(tài)培養(yǎng),從以下方面檢測(cè)電容耦合電刺激對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖的影響: 1、倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)改變. 2、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及增殖情況. 3、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞期。 結(jié)果本實(shí)驗(yàn)中人牙髓細(xì)胞在體外可多次傳代培養(yǎng)而保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài),其生長(zhǎng)曲線(xiàn)在8-10天達(dá)到平穩(wěn),流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,CD44、CD90、CD147均為陽(yáng)性,這與間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型相一致。經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后,免疫組化結(jié)果顯示牙本質(zhì)涎蛋白染色陽(yáng)性,茜素紅染色有礦化結(jié)節(jié)形成以及堿磷酶表達(dá)升高,RT-PCR,DSPP表達(dá)陽(yáng)性。經(jīng)電容耦合電刺激后結(jié)果顯示:1、不同頻率的電刺激作用后細(xì)胞形態(tài)和對(duì)照組無(wú)明顯差別。2、MTT檢測(cè)顯示經(jīng)電容耦合電刺激后的人牙髓細(xì)胞增殖能力和對(duì)照組明顯不同,其中50Hz刺激組生長(zhǎng)曲線(xiàn)最高,明顯快于其他頻率刺激組(P0.01)。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明,經(jīng)電容耦合電刺激作用以后,所有樣本均未發(fā)現(xiàn)有DNA倍體異常的細(xì)胞(diploid:100%);人牙髓細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生了改變,S期細(xì)胞百分比和刺激頻率有關(guān)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)從人年輕恒牙獲得的人牙髓細(xì)胞易于分離培養(yǎng),細(xì)胞狀態(tài)較原始,具有干細(xì)胞特性,經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞,提示其具有作為牙組織工程種子細(xì)胞的潛能。頻率是影響電容耦合電刺激細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的重要因素之一,頻率不同,其產(chǎn)生的促細(xì)胞增殖效應(yīng)不一,50kHz可能是促進(jìn)人牙髓細(xì)胞體外增殖的適合頻率。
【學(xué)位單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類(lèi)】：R78
【部分圖文】：

表 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同頻率刺激后人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞周期組別細(xì)胞周期（%）G1 S G2 對(duì)照組5KHZ25KHZ50KHZ**75KHZ100KHZ79.0873.7476.4271.7273.6579.0815.7818.9422.9723.6021.1813.445.137.593.602.757.115.13N＞10000，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較 P＜0.05，**表示 P＜0.01

53圖11 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性×100 圖12 經(jīng)誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞 DSP 染色陽(yáng)性×200圖13RT-PCR 結(jié)果圖 圖14 電刺激培養(yǎng)裝置圖圖15 對(duì)照組 圖16 電刺激組ALP活性0204060

53圖11 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性×100 圖12 經(jīng)誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞 DSP 染色陽(yáng)性×200圖13RT-PCR 結(jié)果圖 圖14 電刺激培養(yǎng)裝置圖圖15 對(duì)照組 圖16 電刺激組ALP活性020406080100120140融和前 融?
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870742