[研究目的]研究OSCC患者腫瘤組織及外周血中DC的IDO及PD-L1表達水平,并進行生存預后分析;研究OSCC患者腫瘤組織及外周血中VEGF的表達水平,分析其與tol-DC的相關性;初步探討VEGF誘導tol-DC的相關分子機制。[研究方法]1、免疫熒光檢測OSCC腫瘤組織冰凍切片中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+雙陽性細胞的存在。2、收集50例OSCC腫瘤組織,采用免疫組化雙染檢測OSCC患者腫瘤組織中tol-DC即IDO+CD1a+、PD-LI+CD1a+;免疫組化檢測VEGF的表達情況,分析tol-DC與生存預后及臨床病理學參數(shù)的相關性,以及與VEGF的相關性。3、采集25例OSCC患者及20例健康人外周血,流式細胞儀檢測其Mo-DC、pDC的比例,及其表達PD-L1的情況,Elisa檢測外周血血清中VEGF的含量,并分析其相關性。4、外周血中PBMC誘導為DC,iDC向mDC分化過程中,加入外源性VEGF因子刺激,觀察DC表型的變化及其相關因子表達水平的變化。5、小鼠骨髓單核細胞誘導DC,分組:(1)iDC組;(2)mDC組;(3)VEGF組;(4)VEGFR1抑制劑組;(5)VEGFR2抑制劑組。采用Western blot檢測各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IDO、PD-L1的表達情況。[實驗結果]1、免疫熒光結果顯示OSCC組織中存在IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+,為后續(xù)實驗提供基礎。免疫組化雙染結果示:IDO+CD1a+雙陽性細胞在OSCC患者腫瘤組織中的數(shù)量明顯高于正常組織(P0.05),為分析OSCC中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+雙陽細胞的數(shù)量對患者預后的意義,我們評估了 IDO+CD1a+、PD-L1+CDla+雙陽性細胞與臨床病理特征之間的相關性。在50例患者中,有21例高表達IDO+CDla+雙陽性細胞,并且與腫瘤分期(P=0.0065)、淋巴結轉移(P0.0001)、復發(fā)(P=0.029)、WPOI(P=0.044)有密切相關性。而在50例患者中,有19例高表達PD-Ll+CD1a+雙陽性細胞,并且與淋巴結轉移(P=0.0169)、復發(fā)(P=0.0147)、分化程度(P=0.0187)有密切相關性。我們的數(shù)據(jù)表明,表達IDO+CDla+、PD-L1+CDla+數(shù)量較高的患者存活率與OS和DFS相關,具有統(tǒng)計學差異。COX回歸分析顯示:IDO+CDla+(OS:P=0.029;DFS:P=0.036)、PD-L1+CDla+(OS:P=0.017;DFS:P=0.037)是OSCC中OS和DFS的獨立危險因素,可作為OSCC的獨立預后因素。VEGF在OSCC患者腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織(P0.05),發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達與IDO+CD1a+及PD-L1+CD1a+的高表達密切相關,提示VEGF可能誘導tol-DC高表達IDO及PD-L1。2、流式檢測OSCC患者外周血Mo-DC及pDC均較健康人下降,分析顯示:OSCC患者Mo-DC及pDC的表達較健康對照者明顯降低,這些數(shù)據(jù)表明OSCC微環(huán)境可能促使DC及其亞群減少。OSCC患者血清中VEGF的含量明顯高于健康人,VEGF與Mo-DC的含量呈負相關(P0.05),然而,與pDC的含量呈負相關,但無統(tǒng)計學差異(P0.05)。OSCC患者中Mo-DC較健康人高表達IDO及PD-L1(P0.0001)。這些數(shù)據(jù)表明OSCC微環(huán)境可能促使Mo-DC的IDO、PD-L1分子表達水平升高,使DC向tol-DC轉化。VEGF與Mo-DC表達的IDO、PD-L1均呈正相關(P0.05),證明在OSCC腫瘤微環(huán)境中VEGF可以促使Mo-DC向tol-DC分化,并高表達IDO、PD-L1。3、VEGF刺激后DC的聚集性變差,通過流式細胞儀檢測:與mDC組相比,VEGF組表面的CD83、CD86、CD80、HLA-DR的表達明顯下降(P0.05);VEGF組相較于mDC組分泌的PD-L1、IDO均有增多(P0.05)。這些結果說明VEGF因子可以抑制DC向成熟方向分化,可能使其分化為tol-DC。4、在加入VEGF刺激后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表達明顯增多,在干擾了VEGFR1或VEGFR2后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表達下降,VEGF可以通過VEGFR1/VEGFR2激活JAK2/STAT3通路,誘導DC表達IDO、PD-L1增多。[結論]OSCC腫瘤組織及外周血腫瘤微環(huán)境中的VEGF與DC向tol-DC轉化并高表達IDO及PD-L1密切相關,并且IDO+CD1a+和PD-L1+C1a+雙陽性細胞可作為獨立預后因素;細胞學實驗表明:VEGF可以抑制DC的成熟,并促進其高表達IDO和PD-L1,從而誘導DC像tol-DC轉化,初步探討其機制,可能是因為激活了VEGFR1/VEGFR2-JAK2/STAT3通路,繼而導致DC表達IDO、PD-L1增多,為進一步認識腫瘤免疫耐受的機制提供了新的實驗依據(jù)和思路。
【學位單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

ＧＢＩ－久紅顯色，在一張片子中顯示出褐色和紅色兩種顏色。ＩＤＯ主要表達在胞??漿，免疫組化雙染表現(xiàn)為粉紅色，ＣＤｌａ主要表達在胞膜，免疫組化雙染表現(xiàn)為??褐色。ＤＣ表達ＩＤＯ時，組化片表現(xiàn)為粉色及褐色，即為ＩＤＯ?ＣＤｌａ’（圖２ｂ），??不表達ＩＤＯ時，組化片表現(xiàn)為褐色，即ＩＤＯ?ＣＤｌａ＋?（圖２ａ）。評分方式：在高??倍鏡視野下，隨機選擇５個區(qū)域，計數(shù)其中紅色ＩＤＯ及褐色ＣＤｌａ共表達細胞??占只表達褐色ＣＤｌａ細胞的數(shù)目，一個區(qū)域內(nèi)共表達細胞＞７５％為＋＋＋，５１％－７５％??為＋＋，１１％－５０％為＋，５１０％為陰性。統(tǒng)計學分析表明，ＩＤＣＴＣＤ丨ａ＊共表達細胞在??？ＳＣＣ患者腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織（Ｐ＜０．０５），為分析ＯＳＣＣ??中ＩＤＣＴＣＤｌａ—共表達細胞的表達對患者預后的意義，我們評估了?ＩＤＣＴＣＤｌａ？共??表達細胞與臨床病理特征之間的相關性，見表丨，在５０例患者中，有２１例高表??達丨ＤＯ’ＣＤｌａ＋共表達細胞

OSCC組織中PD一LI奮CDla+

２．３．２?ＯＳＣＣ組織中ＶＥＧＦ的表達及其與ｔｏｌ－ＤＣ的相關性??通過免疫組化方法檢測ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ組織中的表達情況，ＶＥＧＦ主要表達??在胞漿，免疫組化表現(xiàn)為褐色（圖５）。ＶＥＧＦ的評分方式：在高倍鏡視野下，??隨機選擇５個區(qū)域，每個區(qū)域隨機計數(shù)細胞１００個，呈黃色至棕黃色顆粒為陽性??表達，計算出陽性表達的細胞所占的百分比，一個區(qū)域內(nèi)著色細胞＞７５％為４分，??５１％＿７５％為３分，１１％－５０％為２分，＜１０％為１分，陰性為０分。根據(jù)細胞著色??評分：棕褐色－３分，棕黃色－２分，淡黃色－－１分，無著色或與背景一致的淡棕??色－０分。最后兩者積分相乘：０－３為（－），４－６分為弱（＋）?，?７－９分較強（＋＋），??９－１２分為強（＋＋＋）。統(tǒng)計學分析表明，ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ患者腫瘤組織中的表達??水平明顯高于正常組織（Ｐ＜０．０５）。然后，分析ＯＳ、ＤＦＳ和ＶＥＧＦ表達之間的??潛在關聯(lián)
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本文編號：2866908