[研究目的]研究OSCC患者腫瘤組織及外周血中DC的IDO及PD-L1表達(dá)水平,并進(jìn)行生存預(yù)后分析;研究OSCC患者腫瘤組織及外周血中VEGF的表達(dá)水平,分析其與tol-DC的相關(guān)性;初步探討VEGF誘導(dǎo)tol-DC的相關(guān)分子機(jī)制。[研究方法]1、免疫熒光檢測(cè)OSCC腫瘤組織冰凍切片中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+雙陽(yáng)性細(xì)胞的存在。2、收集50例OSCC腫瘤組織,采用免疫組化雙染檢測(cè)OSCC患者腫瘤組織中tol-DC即IDO+CD1a+、PD-LI+CD1a+;免疫組化檢測(cè)VEGF的表達(dá)情況,分析tol-DC與生存預(yù)后及臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性,以及與VEGF的相關(guān)性。3、采集25例OSCC患者及20例健康人外周血,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其Mo-DC、pDC的比例,及其表達(dá)PD-L1的情況,Elisa檢測(cè)外周血血清中VEGF的含量,并分析其相關(guān)性。4、外周血中PBMC誘導(dǎo)為DC,iDC向mDC分化過(guò)程中,加入外源性VEGF因子刺激,觀察DC表型的變化及其相關(guān)因子表達(dá)水平的變化。5、小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC,分組:(1)iDC組;(2)mDC組;(3)VEGF組;(4)VEGFR1抑制劑組;(5)VEGFR2抑制劑組。采用Western blot檢測(cè)各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IDO、PD-L1的表達(dá)情況。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1、免疫熒光結(jié)果顯示OSCC組織中存在IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。免疫組化雙染結(jié)果示:IDO+CD1a+雙陽(yáng)性細(xì)胞在OSCC患者腫瘤組織中的數(shù)量明顯高于正常組織(P0.05),為分析OSCC中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+雙陽(yáng)細(xì)胞的數(shù)量對(duì)患者預(yù)后的意義,我們?cè)u(píng)估了 IDO+CD1a+、PD-L1+CDla+雙陽(yáng)性細(xì)胞與臨床病理特征之間的相關(guān)性。在50例患者中,有21例高表達(dá)IDO+CDla+雙陽(yáng)性細(xì)胞,并且與腫瘤分期(P=0.0065)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.0001)、復(fù)發(fā)(P=0.029)、WPOI(P=0.044)有密切相關(guān)性。而在50例患者中,有19例高表達(dá)PD-Ll+CD1a+雙陽(yáng)性細(xì)胞,并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0169)、復(fù)發(fā)(P=0.0147)、分化程度(P=0.0187)有密切相關(guān)性。我們的數(shù)據(jù)表明,表達(dá)IDO+CDla+、PD-L1+CDla+數(shù)量較高的患者存活率與OS和DFS相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。COX回歸分析顯示:IDO+CDla+(OS:P=0.029;DFS:P=0.036)、PD-L1+CDla+(OS:P=0.017;DFS:P=0.037)是OSCC中OS和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可作為OSCC的獨(dú)立預(yù)后因素。VEGF在OSCC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織(P0.05),發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達(dá)與IDO+CD1a+及PD-L1+CD1a+的高表達(dá)密切相關(guān),提示VEGF可能誘導(dǎo)tol-DC高表達(dá)IDO及PD-L1。2、流式檢測(cè)OSCC患者外周血Mo-DC及pDC均較健康人下降,分析顯示:OSCC患者M(jìn)o-DC及pDC的表達(dá)較健康對(duì)照者明顯降低,這些數(shù)據(jù)表明OSCC微環(huán)境可能促使DC及其亞群減少。OSCC患者血清中VEGF的含量明顯高于健康人,VEGF與Mo-DC的含量呈負(fù)相關(guān)(P0.05),然而,與pDC的含量呈負(fù)相關(guān),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。OSCC患者中Mo-DC較健康人高表達(dá)IDO及PD-L1(P0.0001)。這些數(shù)據(jù)表明OSCC微環(huán)境可能促使Mo-DC的IDO、PD-L1分子表達(dá)水平升高,使DC向tol-DC轉(zhuǎn)化。VEGF與Mo-DC表達(dá)的IDO、PD-L1均呈正相關(guān)(P0.05),證明在OSCC腫瘤微環(huán)境中VEGF可以促使Mo-DC向tol-DC分化,并高表達(dá)IDO、PD-L1。3、VEGF刺激后DC的聚集性變差,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè):與mDC組相比,VEGF組表面的CD83、CD86、CD80、HLA-DR的表達(dá)明顯下降(P0.05);VEGF組相較于mDC組分泌的PD-L1、IDO均有增多(P0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明VEGF因子可以抑制DC向成熟方向分化,可能使其分化為tol-DC。4、在加入VEGF刺激后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表達(dá)明顯增多,在干擾了VEGFR1或VEGFR2后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表達(dá)下降,VEGF可以通過(guò)VEGFR1/VEGFR2激活JAK2/STAT3通路,誘導(dǎo)DC表達(dá)IDO、PD-L1增多。[結(jié)論]OSCC腫瘤組織及外周血腫瘤微環(huán)境中的VEGF與DC向tol-DC轉(zhuǎn)化并高表達(dá)IDO及PD-L1密切相關(guān),并且IDO+CD1a+和PD-L1+C1a+雙陽(yáng)性細(xì)胞可作為獨(dú)立預(yù)后因素;細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明:VEGF可以抑制DC的成熟,并促進(jìn)其高表達(dá)IDO和PD-L1,從而誘導(dǎo)DC像tol-DC轉(zhuǎn)化,初步探討其機(jī)制,可能是因?yàn)榧せ盍薞EGFR1/VEGFR2-JAK2/STAT3通路,繼而導(dǎo)致DC表達(dá)IDO、PD-L1增多,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤免疫耐受的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

ＧＢＩ－久紅顯色，在一張片子中顯示出褐色和紅色兩種顏色。ＩＤＯ主要表達(dá)在胞??漿，免疫組化雙染表現(xiàn)為粉紅色，ＣＤｌａ主要表達(dá)在胞膜，免疫組化雙染表現(xiàn)為??褐色。ＤＣ表達(dá)ＩＤＯ時(shí)，組化片表現(xiàn)為粉色及褐色，即為ＩＤＯ?ＣＤｌａ’（圖２ｂ），??不表達(dá)ＩＤＯ時(shí)，組化片表現(xiàn)為褐色，即ＩＤＯ?ＣＤｌａ＋?（圖２ａ）。評(píng)分方式：在高??倍鏡視野下，隨機(jī)選擇５個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)其中紅色ＩＤＯ及褐色ＣＤｌａ共表達(dá)細(xì)胞??占只表達(dá)褐色ＣＤｌａ細(xì)胞的數(shù)目，一個(gè)區(qū)域內(nèi)共表達(dá)細(xì)胞＞７５％為＋＋＋，５１％－７５％??為＋＋，１１％－５０％為＋，５１０％為陰性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，ＩＤＣＴＣＤ丨ａ＊共表達(dá)細(xì)胞在??？ＳＣＣ患者腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織（Ｐ＜０．０５），為分析ＯＳＣＣ??中ＩＤＣＴＣＤｌａ—共表達(dá)細(xì)胞的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的意義，我們?cè)u(píng)估了?ＩＤＣＴＣＤｌａ？共??表達(dá)細(xì)胞與臨床病理特征之間的相關(guān)性，見(jiàn)表丨，在５０例患者中，有２１例高表??達(dá)丨ＤＯ’ＣＤｌａ＋共表達(dá)細(xì)胞

OSCC組織中PD一LI奮CDla+

２．３．２?ＯＳＣＣ組織中ＶＥＧＦ的表達(dá)及其與ｔｏｌ－ＤＣ的相關(guān)性??通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ組織中的表達(dá)情況，ＶＥＧＦ主要表達(dá)??在胞漿，免疫組化表現(xiàn)為褐色（圖５）。ＶＥＧＦ的評(píng)分方式：在高倍鏡視野下，??隨機(jī)選擇５個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)計(jì)數(shù)細(xì)胞１００個(gè)，呈黃色至棕黃色顆粒為陽(yáng)性??表達(dá)，計(jì)算出陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞所占的百分比，一個(gè)區(qū)域內(nèi)著色細(xì)胞＞７５％為４分，??５１％＿７５％為３分，１１％－５０％為２分，＜１０％為１分，陰性為０分。根據(jù)細(xì)胞著色??評(píng)分：棕褐色－３分，棕黃色－２分，淡黃色－－１分，無(wú)著色或與背景一致的淡棕??色－０分。最后兩者積分相乘：０－３為（－），４－６分為弱（＋）?，?７－９分較強(qiáng)（＋＋），??９－１２分為強(qiáng)（＋＋＋）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ患者腫瘤組織中的表達(dá)??水平明顯高于正常組織（Ｐ＜０．０５）。然后，分析ＯＳ、ＤＦＳ和ＶＥＧＦ表達(dá)之間的??潛在關(guān)聯(lián)
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本文編號(hào)：2866908